[發明專利]一種對硝基苯胺生產工藝

無效

• 申請號: 201310272286.4
• 申請日: 2013-07-02
• 公開（公告）號: CN103305562A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 朱東強;康福星
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種對硝基苯胺生產工藝，其特征在于：一種對硝基苯胺(或4-硝基苯胺，英文名：p-nitroaniline)的生產步驟如下，

(1)M9培養基制備：

該工藝使用枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)生物菌種作為微生物胞外聚合物(EPS)來源，屬于非致病性菌種，優點是生長速度快，24小時內即進入生長穩定期，EPS即Extracellular?Polymeric?Substances的縮寫；該枯草芽孢桿菌生物菌種使用M9培養基培養，所述M9培養基制備步驟如下，

1)M9主培養基配方為：單位為毫摩爾每升，在1L燒杯中加入450mL蒸餾水和以下各成份配成溶液：NH₄Cl0.5g，Na₂HPO₄3.0g，KH₂PO₄1.5g，用NaOH調整pH到7.0-7.5并將溶液體積調整至490-500mL，制得主培養基；

2)制備M9營養液各50ml，如下：1mol/LMgSO₄.7H₂O50ml；15-30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即質量濃度；和1mol/LCaCl₂50ml。

將上述M9主培養基和3種50ml的M9營養液分別通過0.45um濾膜抽濾除菌，或者分別在120℃高壓滅菌20分鐘，滅菌后，無菌條件下取濃度為1mol/L的1mL?MgSO₄·7H₂O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及1mol/L的50mL氯化鈣的營養液分別加入到M9主培養基，充分混勻制得M9培養基備用。

(2)枯草芽孢桿菌的培養及其胞外聚合物EPS提取

該方法使用枯草芽孢桿菌生物菌種作為微生物胞外聚合物(EPS)來源；枯草芽孢桿菌首先在無菌環境接種至所述M9培養基中，接種比為5∶1000～5000；接種后的培養基在37±1℃，150轉/分鐘培養箱中培養24-48小時；在所述24-48小時期間，是微生物胞外聚合物EPS增生階段，培養48小時能獲得最大胞外聚合物(EPS)提取量；

微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：

第1步：取所述M9培養基培養48小時的枯草芽孢桿菌液1L，在6000g離心力下離心分離，移除上清液，收集沉淀下來的細胞；加入去離子水至原體積以重新懸浮枯草芽孢桿菌菌體，6000g離心力下再次離心，移除上清液，收獲沉淀至離心管底的細胞體；該過程再次加入去離子水的目的是清洗枯草芽孢桿菌細胞，以移去殘余培養基；

第2步：將所述第1步沉淀至離心管底的細胞體加入去離子水重新懸浮至500mL，在40～60W功率下超聲10分鐘得溶液備用；目的是增加微生物表面EPS的可剝離度；

第3步：將所述第2步超聲后所得溶液，在11000～20000g離心力下離心20分鐘；用高速離心的方法把微生物表面EPS剝離；

第4步：離心后的上清液經0.45um濾膜抽濾，獲得的抽濾液為枯草芽孢桿菌EPS溶液，溶液保存在0～4℃環境；

第5步：上述提取的枯草芽孢桿菌胞外聚合物(EPS)經冷凍干燥、濃縮為原濃度的1％的微生物胞外聚合物(EPS)濃縮液備用；

(3)對硝基苯胺制備方法

第1步：取對二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的對二硝基苯母液；將所述對二硝基苯母液加入到1L步驟(2)所述的濃縮至1％的微生物胞外聚合物(EPS)濃縮液中，使對二硝基苯濃度達到2g·L^-1；

第2步：將上述第1步混合液在37℃、150轉速/分鐘下水平振蕩反應48小時；

第3步：對于對硝基苯胺的收集；對于所述第2步水平振蕩反應48小時后的混合液，2g/L的對二硝基苯完全轉化為對硝基苯胺；轉化后的溶液是EPS和對硝基苯胺的混合溶液，負60℃下冷凍干燥5天；所獲取的干燥樣品是固態EPS和對硝基苯胺混合物；加入甲醇經80W超聲30min直接從固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取對硝基苯胺，分3次萃取；所獲得的對硝基苯胺甲醇溶液，在40℃條件下旋轉蒸發；所搜集的甲醇蒸出液能重復使用；固體物為對硝基苯胺。