[發明專利]木薯葉多酚氧化酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310271582.2
• 申請日: 2013-07-01
• 公開（公告）號: CN103305483A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 楊洋;候杰;嚴東;馬萬良;胡振興;曾勝
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 翁建華

技術領域

本發明涉及一種木薯葉多酚氧化酶的制備方法。

背景技術

木薯又稱樹薯、木番薯（拉丁學名：Manihot?esculenta?crantz，英文名稱Cassava），屬于大戟科Euphorbiaceae木薯屬Manihot，為多年生灌木狀作物。木薯在全世界熱帶地區廣泛種植，我國主要在兩廣地區及海南島進行栽培。目前對木薯的利用主要是利用其塊狀根加工制備木薯淀粉和酒精、果糖、葡萄糖等，而數量眾多的木薯葉則隨木薯莖稈被丟棄。多酚氧化酶是一種含銅離子輔基的蛋白酶，廣泛存在于植物細胞中，它能催化鄰苯二酚氧化成鄰苯二醌。植物中的多酚氧化酶主要存在于葉綠體的類囊體的基質中，從而不至于發生氧化反應。但當植物體的生理發生病變或者組織受到破壞時，這種酶與底物區域分開的平衡被打破，發生反應生成醌，連鎖反應的結果導致發生果蔬保鮮中常見的褐變問題，直接影響到果蔬等農產品的外觀、風味和營養。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種利用木薯葉提取木薯葉多酚氧化酶的制備方法，該方法能夠從木薯葉獲得高活性的多酚氧化酶，對于研究植物多酚氧化酶的酶學性質及其應用有重要的意義，為木薯的綜合利用提供參考。

本發明以如下技術方案解決上述技術問題：將新鮮木薯葉洗凈剪碎，按每克木薯葉配制pH為6的磷酸緩沖液4毫升，在45℃下加入質量為木薯葉總質量0.8%的纖維素酶作用45分鐘，冷至5℃；然后用高速組織搗碎儀搗碎至糊狀，取出置于5℃下冷凍浸提5小時后進行抽濾，棄去濾渣收集濾液；在5℃下以12000r/min冷凍離心25分鐘，收集離心液即得木薯葉多酚氧化酶粗酶液。木薯葉多酚氧化酶粗酶液純化先采用硫酸銨進行分級沉淀，收集40%至80%飽和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸緩沖液，再采用葡聚糖凝膠sephadex?G-75純化，即得木薯葉多酚氧化酶純化液，經真空冷凍干燥制成凍干粉，即得木薯葉多酚氧化酶。

一種木薯葉多酚氧化酶的制備方法，其特征是將新鮮木薯葉洗凈剪碎，按每克木薯葉配制pH為6的磷酸緩沖液4毫升，在45℃下加入質量為木薯葉總質量0.8%的纖維素酶作用45分鐘，按每克木薯葉加入0.02克的交聯聚乙烯吡咯烷酮，充分混勻，用高速組織搗碎儀勻漿搗碎，在5℃下浸提5小時后采用紗布過濾，濾液用12000r/min5℃冷凍離心25分鐘，收集濾液得到木薯葉多酚氧化酶粗酶液。木薯葉多酚氧化酶粗酶液純化先采用硫酸銨進行分級沉淀，收集40%至80%飽和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸緩沖液，再采用葡聚糖凝膠sephadex?G-75純化，即得木薯葉多酚氧化酶純化液，經真空冷凍干燥制成凍干粉，即得木薯葉多酚氧化酶。

一種木薯葉多酚氧化酶的制備方法，其特征是將新鮮木薯葉洗凈剪碎，按每克木薯葉配制pH為6的磷酸緩沖液4毫升，在45℃下加入質量為木薯葉總質量0.8%的纖維素酶作用45分鐘，加入木薯葉質量4倍的冷丙酮，用高速組織搗碎機搗成勻漿，抽濾，濾液待用；濾餅用冷凍丙酮再次提取抽濾，得到的白色物質，真空干燥，得木薯葉多酚氧化酶丙酮粉；將丙酮粉溶于pH6.0的磷酸緩沖液中提取3h，加入以上所述的待用濾液，在5℃下以12000rmp/min離心25min除去沉淀，取其上清液即為木薯葉多酚氧化酶粗酶液。木薯葉多酚氧化酶粗酶液純化先采用硫酸銨進行分級沉淀，收集40%至80%飽和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸緩沖液，再采用葡聚糖凝膠sephadex?G-75純化，即得木薯葉多酚氧化酶純化液，經真空冷凍干燥制成凍干粉，即得木薯葉多酚氧化酶。

本發明采用了來源廣泛且缺乏利用的木薯葉為主要原料，能夠得到廉價、易得、且活性很高的木薯葉多酚氧化酶，為多酚氧化酶的酶學性質研究及應用提供了高活性的酶，為木薯的綜合利用提供了新的路子。而且采用了微生物酶或交聯聚乙烯吡咯烷酮或丙酮輔助磷酸緩沖液提取法，得到了高活性的木薯葉多酚氧化酶，具有實際應用價值。

具體實施方式

多酚氧化酶在植物的各個組織中都廣泛存在，因為其對植物本身具有多種生理意義,特別在植物抗病中有重要作用。

本發明利用生物和化學提取方法有機結合提取木薯葉多酚氧化酶。

木薯葉多酚氧化酶結合能力最強的底物為焦性沒食子酸，反應最適pH值為7.0，溫度為40℃時，酶促氧化反應的Km值為0.8mol/L,Vmax=0.1510(U/min)。總酶活26000U，總蛋白269.4mg，比活力96.51U/mg。

對木薯葉洗凈剪碎的尺寸沒有嚴格要求，大概是1～3cm左右就行，因為后面還要搗碎！

實施例1