[發明專利]一種高保真DNA聚合酶及其制備和應用

有效

• 申請號: 201310268966.9
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN104250641B
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 葛猛;夏霞宇;余倩;王宏偉
• 申請（專利權）人: 北京福安華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/10
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技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種高保真DNA聚合酶及其制備和應用。

背景技術

DNA聚合酶廣泛應用于分子生物學研究中，如DNA測序、標記、突變和核酸擴增等反應。耐熱DNA聚合酶由于其熱穩定性，在核酸高溫變性的條件下不會失活，是目前核酸擴增的常用酶。根據序列的不同，DNA聚合酶可以分為六大族：A、B、C、D、X和Y，耐熱DNA聚合酶主要屬于A族和B族，并具有相似的生物學性質。A族DNA聚合酶的代表是Taq DNA聚合酶,該聚合酶分離自Thermus aquaticus YT-1的基因組，具有5’-3’的DNA外切酶活性和5’-3’DNA聚合酶活性，其菌株生長于75℃左右的溫泉中，由于其能耐受高溫變性，自發現后被廣泛應用于PCR反應，目前已被開發成多種試劑盒；后來的研究又從其他物種中分離出了多種A族DNA聚合酶，但由于其不具有3’-5’的外切酶校正活性，容易在擴增時摻入錯誤的堿基，導致不能忠實地擴增模板，直到B族DNA聚合酶的發現，才使得高保真地擴增模板成為可能。B族DNA聚合酶主要分離自古細菌，包括廣古菌、泉古菌、納古菌和初古菌，其具有更高的熱穩定性，同時其3’-5’外切酶校正活性能識別錯誤摻入延伸鏈中的堿基，并將其切下，利用DNA聚合酶活性添加為與模板互補的堿基，從而保證了新擴增鏈與模板的高度一致性。

超嗜熱古菌具有嚴格厭氧和超嗜熱生長的特性，如Pyrodictium和Methanopyrus屬的物種能在110℃生長，而低于80℃則不能生長；從大西洋中脊3650米的超熱煙囪中分離的Pyrolobus fumarii是目前已知最耐熱的古菌，其能在高達113℃的高溫條件下增值，而低于90℃則停止生長。目前已經從Pyrococcus和Thermococcus屬中分離出了許多DNA聚合酶，某些DNA聚合酶在極高的溫度下仍能保持穩定，被應用于分子生物學研究，尤其是核酸擴增中。其中，Pfu DNA聚合酶是一種來源于Pyrococcus furiosus的熱穩定的DNA聚合酶，具有5’-3’DNA聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性。由于Pfu DNA聚合酶有3’-5’的外切酶活性，因此在核酸擴增過程中出錯的機率大大降低，保真性約為Taq DNA聚合酶的6倍。目前，Pfu DNA聚合酶通常作為首選的高保真DNA聚合酶，用于核酸的高保真擴增，但是，在實際應用過程中，Pfu DNA聚合酶對引物和樣品的結構、純度和濃度要求比較高，反應靈敏度較低，擴增效率較低，限制了Pfu DNA聚合酶的使用和推廣。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種高靈敏度、高擴增效率的高保真DNA聚合酶及其制備和應用。

為了實現本發明的目的，本發明采用如下的技術方案：

本發明提供了一種高保真DNA聚合酶，命名為Tco DNA聚合酶，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一個：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列。

本發明提供了一種Tco DNA聚合酶在核酸擴增中的應用，Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一個：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列。

本發明提供了一種編碼Tco DNA聚合酶的DNA分子，其具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一個：

Ⅰ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

Ⅱ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列；

Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一個：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列。

本發明提供了一種重組載體，其含有編碼Tco DNA聚合酶的DNA分子，該DNA分子具有具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一個：

Ⅰ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；