[發明專利]一種低溫中性纖維素酶的制備及復配方法

在審

• 申請號: 201310268728.8
• 申請日: 2013-07-01
• 公開（公告）號: CN103289977A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 姜寬宏
• 申請（專利權）人: 上海尚志生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N13/00;C12R1/885
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種低溫中性纖維素酶的制備及復配方法。

背景技術

纖維素酶(cellulase)是一種重要的酶產品，主要由外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，能降解纖維素β-1，4糖苷鍵生成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質的一組酶的總稱，是一種復合的誘導酶，包括多種水解酶。纖維素酶的工業化應用主要集中在生物能源，釀造工業，洗滌工業，造紙工業及紡織工業等行業中。在生物能源方面，纖維素酶將纖維素物質徹底的分解，其水解產物變成單糖，再將其進一步發酵，便可產生生物柴油；在釀造工業中，可用于啤酒的生產，增加發酵糖的產量，也可用于醬油的釀造，增加醬油的產量以及改善其質量；在洗滌工業中，纖維素酶加到洗滌劑中，能將水合纖維素分子徹底破壞，徹底清除封閉在纖維內部的污漬，提升洗滌效果；在造紙工業中，纖維素酶能使纖維表面改性，減少機械打漿的能耗；在紡織工業中，用于棉麻的后整理，纖維素酶能降低反應溫度，使反應條件溫和，織物整理平滑觸感好。

雖然國內外對纖維素酶的研究有50多年的歷史，但主要集中在中溫、高溫纖維素酶，而有關10～15℃下纖維素酶的研究則比較少。尤其是在國內，可以作為商業化的低溫中性纖維素酶更是鮮有存在。但工業上使用中、高溫纖維素酶對工藝和設備要求高且比較耗能，因此研究低溫中性纖維素酶的制備與應用具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種低溫中性纖維素酶的制備及復配方法，以克服目前應用中溫、高溫纖維素酶所帶來的不足。該方法主要是利用里氏木霉菌株，通過紫外誘變，低溫培養，然后于10～15℃的發酵液中產生低溫中性纖維素酶，并研究了其復配方法及在造紙工業中的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現：

一種低溫中性纖維素酶的制備方法，選用里氏木霉制備所述的低溫中性纖維素酶，所述的制備方法包括以下步驟：

(1)將里氏木霉菌株接種到斜面活化培養基上，活化菌種；培養活化后的菌種，挑取單菌落制備孢子懸浮液，并用紫外照射孢子懸浮液，誘變得到孢子菌落；

(2)將(1)中的孢子菌落涂布于初篩培養基中，在10～15℃下培養3～5天，挑選初篩菌株并純化該菌株；

(3)在10～15℃下，將(2)中的純化菌株按5％的接種量接種于發酵培養基中，逐級擴大培養制備種子液，培養時間為48～72小時；

(4)將(3)中的種子液按發酵液體積3～5％的接種量接種于產酶培養基中，10～15℃培養96～144小時，即里氏木霉發酵生產低溫中性纖維素酶結束；將發酵液在4000～6000rpm離心，收集所得液體為粗酶液；

(5)將(4)得到的粗酶液進行超濃縮過濾，得到1000～2000UI/G的濃縮酶液。

優選地，所述初篩培養基選用60.0～80.0g馬鈴薯，0.5g?K₂HPO₄，2.0～2.4g明膠，20.0～25.0g瓊脂和1.0L蒸餾水制備，并將制備好的所述初篩培養基在溫度為115℃～121℃的高壓蒸汽下滅菌30分鐘。

優選地，所述發酵培養基選用3.0～5.0g玉米粉，0.5～1.0g蛋白胨，0.8～1.2g(NH₄)₂SO₄，1.2～1.8g?KH₂PO₄，0.1～0.3g尿素，0.1～0.2g?CaCl₂和1.0L蒸餾水制備，并將制備好的所述發酵培養基在溫度為115℃～121℃的高壓蒸汽下滅菌30分鐘。

優選地，所述產酶培養基選用70～80g麩皮，15～20g米糠，0.15～0.2g羧甲基纖維素，0.05～0.1g(NH₄)₂SO₄，0.05～0.1g?MgSO₄，0.1～0.15g?K₂HPO₄和1.48～1.52L蒸餾水，并將制備好的所述產酶培養基在溫度為115℃～121℃的高壓蒸汽下滅菌30分鐘。

一種采用前述技術方案獲得的低溫中性纖維素酶的復配方法，所述濃縮酶液與表面活性物質、防腐劑、穩定劑等中的一種或多種組分進行復配，其質量百分比分別為：濃縮酶液10～50％，表面活性物質5～10％，防腐劑0.1～1％，穩定劑1～30％，其它：去離子水，即復配成可用于造紙工業的低溫中性纖維素酶制劑。