[發明專利]一種副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原CdtB

無效

• 申請號: 201310268250.9
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103319575A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 王春來;李剛;張艷禾;謝芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/285
• 分類號: C07K14/285;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/102;A61K48/00;A61P31/04;C12R1/21
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發明涉及動物傳染病亞單位疫苗制備技術領域。具體涉及一種副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原的鑒定、蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在疫苗中的應用。

背景技術

細胞致死膨脹毒素是細菌蛋白毒素家族最新發現的一員，最早發現于大腸桿菌的培養液上清中，體外作用于中國倉鼠卵巢細胞(Chinese?hamster?ovary?cells，CHO)能夠導致靶細胞膨脹和死亡，因此該毒素被命名為“細胞致死膨脹毒素”。目前，CDT是細菌毒素中唯一具有DNA酶(DNase?I)活性的毒素，具有遺傳毒害作用，導致DNA雙鏈斷裂，在哺乳動物細胞中引起不可逆的細胞周期阻滯和凋亡。

現已證實多種革蘭氏陰性致病菌，均可產生該毒素。晶體結構研究表明CDT全毒素是由CdtA、CdtB和CdtC構成的三聚體復合物，三個亞基分別由cdtA、cdtB、cdtC基因編碼。

研究發現細胞致死膨脹毒素作用于真核細胞，培養72-96h后吉姆薩染色發現能夠使細胞發生膨脹；作用細胞72h后發現相較于對照組，實驗組細胞數目變化不明顯，試驗證實該毒素能使細胞循環周期停滯在G2/M期；通過顯微注射技術將CDTs全毒素注射到細胞內，發現DNA雙鏈斷裂，表明該毒素具有DNA酶活性。成纖維細胞、上皮細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和樹突狀細胞在CDTs的作用下，不會發生細胞膨脹和循環周期的阻滯，而是直接導致凋亡和裂解成細胞碎片。研究認為CdtB亞基是CDT全毒素的保守亞基，也是功能亞基，具有和DNase?I相似的結構和功能，該亞基體外處理質粒DNA，能夠導致DNA的線性化，將CdtB顯微注射到細胞，發現該亞基不僅能夠導致靶細胞的膨脹和細胞循環周期的阻滯，而且能夠導致靶細胞DNA雙鏈的斷裂，這就說明CdtB的靶目標是DNA。CdtB亞基的DNA酶活性是CDT全毒素發揮細胞毒性作用的關鍵，CdtA和CdtC沒有類似DNase的活性，不能導致靶細胞的膨脹和凋亡，二者的主要作用是結合于細胞膜表面，促進CdtB進入細胞核發揮其細胞毒性作用，但是它們是怎樣發揮作用的以及完成使命后它們的去向如何仍不清楚。

副豬嗜血桿菌(Haemophilus?parasuis，Hps)是一種革蘭氏陰性菌，常定居于豬的上呼吸道，是一種條件致病菌，能夠導致豬的副豬嗜血桿菌病。在1910年首次報道該菌，因此該病又稱為革拉瑟氏病(disease)。Hps只感染豬，能夠影響2周齡到4月齡的豬，發病常見于5～8周齡豬。發病率為10％～15％，嚴重時死亡率可達50％，給養豬業帶來巨大損失，該病的主要特征為纖維素性胸膜炎、腹膜炎、關節炎、心包炎和腦膜炎。

本研究通過克隆、表達編碼CdtB的基因，并將純化后的蛋白免疫小鼠，發現其對小鼠感染副豬嗜血桿菌能提供有效的免疫保護力，可以作為副豬嗜血桿菌亞單位疫苗開發的候選抗原。

發明內容

本發明的目的是提供能夠用于制備副豬嗜血桿菌亞單位疫苗的候選抗原的蛋白及其編碼基因。

本發明鑒定到具有免疫保護效果的CdtB蛋白，并對小鼠感染副豬嗜血桿菌能提供有效的免疫保護力，可以作為副豬嗜血桿菌病亞單位疫苗開發的候選抗原。

為了實現本發明目的，本發明首先克隆了副豬嗜血桿菌的CdtB基因，然后將該基因連接于表達載體中重組表達CdtB蛋白，使用豬的康復血清對純化后的蛋白進行western-blot雜交發現其具有免疫原性，將表達的蛋白純化后進行小鼠的免疫保護試驗，結果表明其具有一定的免疫保護作用。

本發明同時保護一種制備CdtB蛋白的方法，所述方法包括培養含有CdtB蛋白編碼序列的重組大腸桿菌，得到CdtB蛋白。所述制備CdtB蛋白的方法具體可為：將所述重組菌37℃培養3h，OD₆₀₀＝0.7時，加入IPTG至終濃度0.8μM，轉至37℃繼續培養4h。

本發明的CdtB蛋白具有免疫保護活性。

本發明的CdtB蛋白可以應用于副豬嗜血桿菌病亞單位疫苗的制備。

更具體地，本發明提供以下各項：

1.一種副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.編碼根據1所述的副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原的核酸，其序列如SEQ?ID?NO：2所示。

3.重組載體，其包含根據2所述的核酸。

4.包含根據2所述的核酸或根據3所述的重組載體的細胞。

5.根據1所述的副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原，其用作副豬嗜血桿菌亞單位疫苗。