[發明專利]一種評估蜜蜂幼蟲抗白堊病能力的方法

有效

• 申請號: 201310267566.6
• 申請日: 2013-07-01
• 公開（公告）號: CN103305585A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 蘇松坤;晏勵民;尹志紅;尹君
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12R1/645
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明涉及一種評估西方蜜蜂幼蟲抗白堊病能力的方法。

背景技術

蜜蜂白堊病是由蜜蜂球囊菌引起的蜜蜂幼蟲死亡的真菌性疾病，該病已蔓延至世界各地并且發生率仍在上升。蜜蜂幼蟲主要通過攝食真菌孢子患病，孢子侵染幼蟲后，于封蓋期在幼蟲體內末端開始生長，菌絲迅速膨脹，穿過上皮層，三天后就能穿透蟲體，繼續在空氣中生長。大部分幼蟲在封蓋期死亡，白堊病死亡的幼蟲逐漸萎縮干枯至僵硬狀，死亡幼蟲最后變成石灰樣的白色、灰色或黑色硬塊。白堊病早在二十世紀初就已經被發現，逐漸傳播至整個世界范圍，當前蜜蜂白堊病已經成為對我國西方蜜蜂健康危害十分嚴重的蜜蜂疾病。

蜜蜂的衛生行為是指蜜蜂能夠檢查、咬開封蓋巢房并清除巢房內已被病害感染的蜜蜂幼蟲的一種行為。一般情況下，若要檢查蜂群是否具有衛生行為可通過檢測蜂群在24h、48h后對冷凍致死的封蓋仔的清除能力。美國學者在培育抗病的蜜蜂品系時，發現清巢能力強的蜜蜂品系很少患美洲幼蟲腐臭病、白堊病及被蜂螨寄生。蜜蜂個體從患病幼蟲中察覺到化學刺激，之后就迅速從巢房中移走患病幼蟲，從而減少病原菌的傳播，這是蜜蜂的一種群體免疫機制的具體表現。神經生物學相關研究證實：患病蜂群查探到病原菌時間的長短對于其抗病能力而言至關重要，蜜蜂必須在病原菌的感染力達到一定程度之前偵察到并移走患病蜜蜂個體，否則當病原菌達到傳播水平，移走患病蜜蜂的過程可能會加劇病原菌的傳播。研究發現具有較強衛生行為的蜂群其優勢在于能夠在早期發現感染幼蟲的死亡并在它們變成干尸之前將其迅速清出巢房。

縱觀國內外白堊病的研究進展，單純依靠藥物治療措施，達不到令人滿意的效果，反而增加了防治成本，引發蜂產品中藥物殘留超標問題，如果不采取有效措施，該病仍會廣泛流行。因此，培育抗白堊病蜂種將成為根治白堊病的理想途徑，有些蜂群在感染白堊病后仍能存活，表現出良好的抗病性狀，在對這些具有抗病性狀的蜂群進行深入研究后，發現其存在一種或多種的行為或生理特征并決定其抗病性。因此，通過對抗病力強的蜂群和弱抗病力蜂群進行基因篩選，尋找與抗白堊病相關的分子標記進而開展蜜蜂抗白堊病蜂種的分子輔助選育顯得十分迫切。

目前，主要通過檢測蜂群的清理率來評估蜂群蜜蜂幼蟲的抗病能力，清理能力代表蜂群中成年蜜蜂的抗病能力,而對于幼蟲的抗白堊病能力，尚未見文獻報道。我們在試驗研究過程中發現，采用恒溫恒濕培養箱，移取1日齡蜜蜂幼蟲入細胞培養板培養，于34~35?℃溫度、75~90%濕度下用蜜蜂幼蟲培養飼料培養幼蟲，三天后用白堊病病原菌孢子懸浮液對蜜蜂幼蟲進行白堊病病原菌接種，接種后的6天之內統計幼蟲白堊病死亡個數，死亡個數越少說明該蜂群蜜蜂幼蟲的抗白堊病能力越強，采用此方法可準確判斷蜂群蜜蜂幼蟲的抗白堊病能力。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種評估蜜蜂幼蟲抗白堊病能力的方法，從而準確地篩選抗白堊病能力強的蜂群作為蜜蜂抗病育種的素材。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種評估蜜蜂幼蟲抗白堊病能力的方法，包括如下步驟：????

（1）將白堊病干尸用質量濃度為10%的次氯酸鈉消毒約10分鐘后，用滅菌蒸餾水清洗2次，放在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，于34℃培養約2-4天，在培養基上長出菌絲；

（2）待菌絲變成黑色，即長出孢子后，用滅菌解剖刀將培養基上的黑色菌絲（含孢子）分離轉移至滅菌過的研缽中，加入20uL滅菌的去離子水，進行研磨；研磨之后，加入50uL滅菌的去離子水使得孢子懸浮；懸浮液放置20分鐘，從懸浮液的中部取50uL的樣品；用血球計數板測定孢子濃度；配制成5×10⁵個/ml的孢子懸浮液備用；?

（3）取一張工蜂巢脾放入蜂群中，將蜂王置于脾上產卵８小時，將已產卵巢脾放在蜂群的無王區，三天后，卵孵化為一日齡幼蟲；

（4）將一日齡幼蟲用滅菌過的48孔板培養；配制幼蟲食物，幼蟲食物按質量配比計：新鮮蜂王漿50%、D-葡萄糖6%，D-果糖6%，酵母提取物1%，余量為滅菌的去離子水；食物保存于4℃冰箱中，飼喂之前34℃加熱10分鐘；用消毒之后的干燥的移蟲針移取1日齡幼蟲，之后幼蟲于34.5℃溫度、90%濕度的恒溫恒濕箱中黑暗培養；幼蟲在每天相同的時間飼喂一次；幼蟲開始培養后的第一、二、三天每天喂20ul食物，三天后，每天增加10ul食物；第三天飼喂前6小時向每個蜜蜂幼蟲接種步驟2配置的孢子懸浮液10ul；第七天幼蟲開始化蛹，化蛹之后培養條件為34.5℃，75%濕度；不再喂食，每天用棉簽輕輕擦拭板上的幼蟲食物殘渣和雜物；