[發明專利]一種鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株的方法

有效

• 申請號: 201310265390.0
• 申請日: 2013-06-27
• 公開（公告）號: CN103320535A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 郭鵬舉;張建峰;張春紅;饒丹;嘎利兵嘎;沈海燕;周恒;朱余軍;郭翠麗
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物衛生研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發明涉及一種鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株的方法。

背景技術

豬瘟(Classical?swine?fever,?CSF)是由豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus,?CSFV)?引起的一種以患豬高熱稽留、出血和高死亡率為主要特征的接觸性和高度致死性疾病,被世界動物衛生組織列為A類傳染病。

CSFV基因組長約12.3kb，為單股線狀正鏈RNA,由5’UTR、ORF和3’UTR構成。ORF編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白。從5’端到3’端,CSFV的ORF可翻譯4種結構蛋白（C,Ems,El,E2)和8種非結構蛋白(Npro,P7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,和NS5B)。其中囊膜糖蛋白E2基因是誘導產生保護性中和抗體的主要抗原結構蛋白；CSFV的3’UTR被認為與病毒基因組的復制、翻譯以及復制和翻譯的調控有關。

中國在1954年就成功研制出了豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV株),被世界公認是最優秀的豬瘟疫苗并應用至今。但由于HCLV株免疫豬群在血清學上無法區分是疫苗接種產生的抗體還是由于野毒株感染產生的抗體,因此西歐等國家一直奉行不接種政策,阻礙了HCLV株的推廣應用。

在CSFV的診斷方面相繼建立了病毒分離、動物試驗（如兔體交叉免疫試驗）和多種血清學診斷方法。用于檢測抗體的主要有中和試驗、瓊脂擴散試驗、補體結合反應試驗、間接血凝試驗、Dot-ELISA、E2-ELISA、E^rns-ELISA；PPA-ELISA和直接免疫熒光試驗主要用于檢測抗原；間接免疫熒光試驗既可以用于檢測抗體又可以檢測抗原。但病毒分離和動物試驗不同程度的存在診斷周期長、操作繁瑣、檢出率低等不足；常規的血清學試驗又都存在一定的血清學交叉反應，難以將CSFV與同屬的BVDV和BDV感染區分開，也很難鑒別CSFV野毒株感染和疫苗接種。幾種具體的檢測方法介紹如下：

（1）病毒分離鑒定：

采用細胞培養法分離病毒診斷豬瘟具有高靈敏度。采集病毒的血液、可疑臟器組織，經研磨、離心、過濾除菌，接種于對豬瘟病毒敏感的細胞系如PK-15、PK-2a、ST等；培養后用熒光抗體染色法檢測細胞培養物中的病毒。該方法最大的缺點是費時、昂貴，不易對大量樣品進行檢測。

（2）動物接種方法，主要包括三種：

①接種可疑病料乳劑或新鮮血液于易感仔豬(10～20kg，母源抗體下降至不足以保護時，并且未經過豬瘟疫苗免疫)，如果豬接種后1周左右發病，可采血分離病毒，如果3周左右發病，可采血檢測豬瘟中和抗體，并用強毒攻擊。如果分離到CSFV或接種產生CSFV中和抗體，并對豬瘟強毒攻擊呈現免疫性，即可判斷豬瘟陽性。

②豬瘟高免血清皮下注射試驗豬1頭，然后接種待檢病料，另一頭豬不注射高免血清，只注射待檢病料，前者不發病，后者發病，即可判斷豬瘟陽性。

③家兔接種試驗。原理是CSFV野毒不引起家兔體溫反應，但能使家兔產生免疫力，而C株豬瘟兔化弱毒能使家兔產生定型發熱反應，但對已產生免疫力的家兔不發生體溫反應。方法是將待檢病料乳劑上清，經耳靜脈注射兔，每日測溫2～3次，一周后耳靜脈接種C株兔化弱毒，每天測體溫，根據體溫反應判定結果。用本方法能檢出被查病料中可能存在的豬瘟病毒強毒和兔化弱毒株。缺點是試驗周期較長，9d才能出結果。

動物接種法特異性高，可直接確診，但檢測周期長，成本高，且費時費力，還需保證生物安全，因此一般情況下不采用。

（3）酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：

ELISA原理是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。該方法具有高度敏感性和特異性，且它的試劑比較穩定，操作簡單且無放射性危害，特別是商品試劑盒和自動化儀器的應用使其成為一種廣泛使用的免疫標記技術。大量用于豬瘟檢查的ELISA方法運應而生。ELISA方法檢查豬瘟抗體已經比較成熟，國內外均形成了成熟的商品化試劑盒，在實驗室與基層都得到了很好的運用。但在檢查豬瘟病原方面，市場上雖已有商品化試劑盒，目前仍然存在敏感性不夠，非特異性明顯的問題，僅適用于發病豬的檢測，在溫和性豬瘟與持續性帶毒較為普遍的情況下，豬瘟抗原ELISA方法還有待提高。

（4）RT-PCR：

RT-PCR是指從血液、病料組織中提取病毒RNA,進行反轉錄和PCR擴增，最后電泳紫外燈下觀察有無目的條帶的方法。用此方法檢測CSFV特異性強、靈敏度高、重復性好，整個過程1d內即可完成，能達到快速檢測的目的。且RT-PCR還可區別與CSFV相關的病毒，如BVDV，BDV等。