[發明專利]人類Y染色體SY84、SY134和SY255位點缺失的PCR檢測液

無效

• 申請號: 201310264570.7
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103333965A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 張彩霞;曾橋;薛志剛
• 申請（專利權）人: 浙江星博生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及人類Y染色體缺失的PCR檢測技術，具體涉及人類Y染色體SY84、SY134和SY255位點缺失的PCR檢測液。

背景技術

育齡夫婦中約有10%～15%不育，其中病因在男性的占50%，除輸精管道梗阻﹑感染等明確病因外，遺傳性狀改變也是其中一個重要的原因，主要是男方生精障礙，表現為嚴重少精（小于2×10⁶/mL～5×10⁶/mL）或無精子。臨床不育的男性中大約有20%是由遺傳性、非梗阻性的無精癥或少精癥引起的，這些患者大多染色體核型檢測正常；但Y染色體微缺失導致遺傳性不育。目前一般通過STSs進行PCR?來獲取Y染色體微缺失信息，然而各文獻報道的缺失率從1%～55%各不相同，所使用的STSs數量和位點可在1～131個STSs范圍內變化，包括sY84（AZFa區）、sY134（AZFb區）、sY255（AZFc區）等STS位點。PCR檢測這些STS位點時，操作中需要將水、鎂離子、緩沖液（KCl和Tris-HCl等）、dNTP、引物、酶等分步驟逐漸加入到反應體系，操作過程繁瑣，加入的各組分的配比比例不同，核酸的擴展效率不一，且存在反復凍融時擴增效率急劇下降等問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種低溫長期保存、耐受反復凍融，使用時只需加入DNA模板的人類Y染色體SY84、SY134和SY255位點缺失的PCR檢測液。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：人類Y染色體SY84、SY134和SY255位點缺失的PCR檢測液，包括鎂離子（Mg²⁺）、dNTP、Taq酶、氯化鉀（KCl）、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）、SY84引物、SY134引物和SY255引物，該PCR檢測液中鎂離子的濃度為2.632mM，dNTP的濃度為0.263mM，Taq酶的濃度為105u/mL，氯化鉀的濃度為50.63mM，pH值?8.3的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的濃度為10.53mM，SY84引物的濃度為0.263μM，SY134引物的濃度為0.421μM，SY255引物的濃度為0.263μM。

與現有技術相比，本發明優點在于本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：人類Y染色體SY84、SY134和SY255位點缺失的PCR檢測液，包括鎂離子、dNTP、Taq酶、氯化鉀、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、SY84引物、SY134引物和SY255引物，該PCR檢測液中鎂離子的濃度為2.632mM，dNTP的濃度為0.263mM，Taq酶的濃度為105u/mL，氯化鉀的濃度為50.63mM，pH值為8.3的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的濃度為10.53mM，SY84引物的濃度為0.263μM，SY134引物的濃度為0.421μM，SY255引物的濃度為0.263μM；該PCR檢測液可以在低溫中長期保存，能耐受反復凍融，檢測時只需加入DNA模板，操作簡便，快速，擴增的特異性和靈敏性效果。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1

人類Y染色體SY84、SY134和SY255位點缺失的PCR檢測液，該PCR檢測液中Mg²⁺的濃度為2.632mM，dNTP的濃度為0.263mM，Taq酶的濃度為105u/mL，KCl的濃度為50.63mM，Tris-HCl?（pH值為?8.3）的濃度為10.53mM，SY84引物的濃度為0.263μM，SY134引物的濃度為0.421μM，SY255引物的濃度為0.263μM。該PCR檢測液可以在-20℃低溫長期保存，使用時凍融也不影響檢測效果，檢測時只需加入DNA模板，操作簡便，快速。Taq酶為自己制備,dNTP購于寶生物工程(大連)有限公司公司，SY84引物、SY134引物和SY255引物購于英濰捷基（上海）貿易有限公司。

實施例2

用柱洗脫法提取抗凝全血中的人DNA，作為模板DNA；檢測時，在實施例1的PCR檢測液中加入1uL?DNA模板，在Eppendorf?PCR儀中進行PCR擴增反應。PCR循環條件為:94℃預變性5min，然后94℃變性30sec，57℃復性30sec，72℃延伸60sec，反應33個循環后，72℃再延伸10min；PCR產物于可以在4℃冰箱儲存。取10uL?PCR?產物，Gel?red染色，經2%瓊脂糖電泳，電泳電壓5V/cm，電泳時間35min，反應產物條帶位置及長度；若AZFa區域出現326bp條帶，則SY84未缺失，若AZFb區域出現301bp條帶，則SY134未缺失，若AZFc區域出現126bp條帶，則SY255未缺失，反之就出現基因缺失現象，臨床表現少精或無精。