[發明專利]神經肽Y的cRNA原位雜交探針及其制備方法

無效

• 申請號: 201310264200.3
• 申請日: 2013-06-27
• 公開（公告）號: CN103290007A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 王紅濤;胡澤嵐;鄭靜;熊志奇;李奎;祖勇;沈嬌寧;劉霽緯;朱志川;劉永杰
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物醫學，尤其涉及一種神經肽Y的cRNA原位雜交探針及其制備方法。?

背景技術

神經肽Y是廣泛存在于哺乳動物中樞和外周系統的含量最豐富的神經肽之一。在中樞神經系統中，其功能主要包括：促進食物攝取，促使能量轉化為脂肪，抗焦慮，抗癲癇，減輕痛覺，降低血壓。通常被作為節食藥物的靶點，但其在外周系統，它和糖皮質激素和兒茶酚胺可以共同增強應激反應，在應激引起的心血管疾病中起了重要作用。神經肽Y發揮其功能主要通過與它的受體結合來完成，目前已報道的哺乳動物中NPY受體有五種亞型，其中四種在人體內行使功能，Y1和Y5在刺激飲食方面發揮功能，而Y2和Y4對飽腹感進行控制。在形態學方面對動物體內神經肽Y的mRNA水平檢測尚屬空白。?

發明內容

本發明的目的，就是為了提供一種神經肽Y的cRNA原位雜交探針及其制備方法。?

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：?

一種神經肽Y的cRNA原位雜交探針，其序列如SEQ?ID?No.1所示。?

上述神經肽Y的cRNA原位雜交探針的制備方法，包括以下步驟：?

(1)根據Gene?bank提供的神經肽Y的mRNA序列設計神經肽Y特異的引物對，并用此引物對擴增出475bp的神經肽Y的片段，作為神經肽Y特異的探針序列：?

(2)構建表達神經肽Y的cRNA探針的質粒；將探針質粒轉入DH5a細菌感受態，細菌培養后測序；?

(3)制備神經肽Y的cRNA原位雜交探針。?

步驟(1)中所述神經肽Y特異的引物對序列如下：?

上游引物5’-tcacagaggcacccagagcag-3’；?

下游引物5’-aatggggcggagtccagcctag-3’。?

步驟(2)的具體做法是：?

(a)將小鼠的cDNA用設計的引物對進行PCR擴增；?

(b)將PCR擴增產物用天根的膠回收試劑盒回收；?

(c)將回收的產物在T4連接酶作用下連入pGEM?T-easy載體；?

(d)將連接好的質粒轉化DH5a細菌感受態，細菌培養后送測序。?

步驟(3)的具體做法是：?

(a)將步驟(2)得到的克隆測序結果用NCBI?BLAST工具比對正確后，判斷確認神經肽Y的探針序列插入載體順序是正向的；?

(b)以該克隆為模板，用T7和SP6引物進行PCR擴增出探針的DNA片段；?

(e)將所得的PCR擴增產物用天根膠回收試劑盒回收；?

(d)用SP6RNA聚合酶對探針進行體外轉錄，得到神經肽Y的cRNA原位雜交探針。?

本發明的有益效果是：本發明對活體動物的模型進行灌注、取材、切片，通過地高辛標記的cRNA探針與組織中神經肽Y的mRNA進行特異性結合，從而方便、準確的觀察到組織中神經肽Y在mRNA水平的變化。本發明使用的神經肽Y的cRNA原位雜交探針對神經肽Y在mRNA水平的顯示有明確的特異性，達到了檢測目的。?

附圖說明

圖1為本發明神經肽Y的cRNA原位雜交探針檢測的神經肽mRNA在下丘腦弓狀核的分布圖(10×)；?

圖2為本發明神經肽Y的cRNA原位雜交探針檢測的神經肽mRNA在大腦皮層的分布圖(10×)。?

具體實施方式

一、引物及探針的設計：?

根據Gene?bank提供的神經肽Y的mRNA序列，設計其特異的引物對，并且用此對引物對擴增出475bp的神經肽Y的片段作為神經肽Y特異的探針序列；引物對序列如下：?

上游引物：5’-tcacagaggcacccagagcag-3’；?

下游引物：5’-aatggggcggagtccagcctag-3’。?

探針序列如SEQ?ID?No.1所示。?

二、神經肽Y的cRNA探針的質粒的構建：?

1.將小鼠的cDNA用設計的引物對進行PCR擴增；?

2.將PCR擴增產物用天根的膠回收試劑盒回收；?

3.將回收的產物在T4連接酶作用下連入pGEM?T-easy載體；?

4.將連接好的質粒轉化DH5α細菌感受態，細菌培養后送invitrogen公司測序。?

三、神經肽Y的cRNA原位雜交探針的制備：?

1.將得到的克隆測序結果用NCBI?BLAST工具比對正確后，判斷確認神經肽Y探針序列插入載體順序是正向的；?