[發明專利]一種抗霉菌芽孢桿菌菌株及其抗菌產物在玉米儲藏中的應用

有效

• 申請號: 201310263918.0
• 申請日: 2013-06-27
• 公開（公告）號: CN103333828A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 李平蘭;叢苑;杜奕君;韓玉竹;盧彥廷;梁志宏
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P1/04;A23B9/28;A23B9/24;C12R1/125
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種抗霉菌芽孢桿菌菌株、菌株產生的抗菌產物對霉菌生長和孢子萌發的抑制作用及其在玉米儲藏中的防霉應用。

背景技術

芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，是一種嗜熱好氧并產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，能產生多種抑菌物質和酶類，具有較強的防霉抗病作用，而且極易分離培養，是目前主要抗菌蛋白生產菌之一。

芽孢桿菌產生抗菌物質的途徑分為核糖體和非核糖體合成兩種。核糖體途徑產生的抑菌物質包括細菌素、類細菌素、酶類和活性蛋白類。非核糖體途徑產生的抑菌物質包括脂肽類和多肽類。芽孢桿菌產生的抗菌物質主要通過溶解細胞壁或細胞膜，造成原生質泄漏使菌絲斷裂或畸形來抑制霉菌生長，同時抑制孢子萌發。

芽孢桿菌抑菌物質已被廣泛應用于小麥、玉米、棉花的植物病害防治當中，但在糧食防霉方面的應用探索極少。目前，生物防腐劑已逐步代替化學防腐劑廣泛用在肉類、果蔬等加工食品中。劉倩（劉倩.大米大帳氣調保鮮技術的研究：[碩士學位論文].天津：天津科技大學，2009）將生物抑菌劑用于大米貯藏上能夠減緩大米的陳化速度。陳偉暢（陳偉暢.大米天然防霉劑的研究：[碩士學位論文].無錫：江南大學，2008）利用天然生姜提取物替代傳統化學防霉劑雙乙酸鈉用于大米的防霉，保鮮效果明顯。但生物防腐劑應用于糧食防霉的報道依然相對較少。

目前，對于玉米的儲藏還主要是通過控制環境因素來抑制微生物的生長。迄今仍沒有芽孢桿菌抗菌產物用于玉米防霉的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種抗霉菌芽孢桿菌菌株，其抗菌產物可在玉米儲藏過程中發揮防霉作用。

本發明的抗霉菌芽孢桿菌菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）LPL-NM45，現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2013年6月19日，保藏號CGMCC?No.7762。

本發明還提供了所述抗霉菌芽孢桿菌的篩選方法，其包括如下步驟：

（1）用LB培養基從不同樣品中分離芽孢桿菌；

（2）用平板對峙法從步驟（1）分離的芽孢桿菌中初步篩選出抗霉菌芽孢桿菌菌株；

（3）對步驟（2）篩選得到的芽孢桿菌的發酵液進行抑菌性測定，進一步篩選出抗霉菌效果最好的芽孢桿菌菌株；

（4）對步驟（3）篩選得到的芽孢桿菌進行形態學、生理生化、16S?rRNA分子生物學分析鑒定。

步驟（1）中，為保證所得菌株的多樣性及安全性，所以盡量考慮從相對安全、且可能具有較多芽孢桿菌的食品及生物環境中選取樣品。所述樣品可為新疆烤馕、濃湯寶、獼猴桃、午餐肉、土壤、鴨血、茉莉花茶、養樂多、檸檬、綠茶、咸鴨蛋、紅棗干、大曲曲心、大曲曲表、豆腐乳、辣椒醬、橄欖菜、白菜、桃花瓣、蜂蜜、花生糖、東北香腸、納豆、醬油、葡萄、海灘沙子、荔枝等。

具體地，步驟（1）為取25g用無菌研缽研碎的固體樣品或取25mL液體樣品，加入到225mL無菌生理鹽水中，充分震蕩，得到樣液，75℃-85℃水浴10-20min，樣液用無菌生理鹽水梯度稀釋10-1000倍后吸取0.1mL涂布LB平板，37℃培養36-48小時，挑取單菌落，劃線純化，對已純化菌株經革蘭氏染色后鏡檢，確認產生芽孢后LB斜面保存，待用。

優選地，步驟（1）中80℃水浴10min。

步驟（2）中，處理組為在PDA平板中央接種直徑5mm的霉菌菌餅，用滅菌竹簽挑取步驟（1）中芽孢桿菌點種在距PDA平板中心25mm處，37℃培養8h后，28℃下培養3d，觀察拮抗作用并測量菌落大小；以單獨接種霉菌菌柄的平板作為對照組，按下列公式計算抑菌率，從步驟（1）分離的芽孢桿菌中初步篩選出抗霉菌芽孢桿菌菌株。

抑菌率(%)=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。

所述霉菌為玉米霉菌黑曲霉(Aspergillus?niger)、草酸青霉(Penicillium?oxalicum)、串珠鐮刀菌(Fusarium?moniliforme)。

步驟（3）中，將步驟（2）篩選得到的抗霉菌芽孢桿菌分別接種于裝有30mL?LB液體培養基的250mL三角瓶中，37℃下140rpm培養48h，發酵液經10000rpm離心12min取得發酵上清液，采用杯碟法測定各菌株發酵上清液的抑菌活性。