[發(fā)明專利]一種從輕度污染的細胞液中挽救細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310259776.0
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103320386A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 姬明麗;千智斌;王煜霞;劉瑞麗;王雷;楊萬才;吳云紅;李陽;李濤;范順陽;王珺;蔣抗
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發(fā)明涉及一種從輕度污染的細胞液中挽救細胞的方法。

背景技術

腫瘤細胞培養(yǎng)過程中經(jīng)常遇到的問題是細胞活性下降、細胞不貼壁、細胞形態(tài)不良、培養(yǎng)液的輕度污染等問題。通常在遇到上述情況時操作者會選擇丟棄細胞，重新復蘇凍存細胞再培養(yǎng)傳代。對于凍存較少或較難獲得的細胞株來說，上述操作存在巨大的浪費，如果可以有一種方法能夠挽救輕度污染的細胞，解除其污染狀態(tài)并使其能夠再次被利用，將給細胞的保存、傳代和培養(yǎng)帶來巨大的便利，并有效避免細胞的資源浪費。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從輕度污染的細胞液中挽救細胞的方法。

本發(fā)明提供的從輕度污染的細胞液中挽救細胞的方法，包括如下步驟：

（1）取輕度污染的細胞液，吸棄上清，然后100g離心5s，棄上清；加入足以覆蓋細胞的培養(yǎng)液并吹打，然后100g離心5s，棄上清；加入足以覆蓋細胞的所述培養(yǎng)液并吹打，然后500g離心10s，棄上清，得到細胞沉淀，將細胞沉淀的體積定義為A體積；加入10倍A體積的雙抗培養(yǎng)液，靜置30s后吸棄上清；加入10倍A體積的所述雙抗培養(yǎng)液并吹打，然后3000g離心120s，棄上清；加入足以覆蓋細胞的所述雙抗培養(yǎng)液并吹打，得到細胞懸液，然后繼續(xù)加入所述雙抗培養(yǎng)液至總體積為20倍A體積，然后在CO₂培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6h；所述輕度污染的細胞液為細胞活力為40%至80%的細胞液；

（2）取完成步驟（1）的培養(yǎng)體系，吸棄除貼壁細胞以外的液體，用雙抗PBS緩沖液沖洗3遍，然后用所述雙抗培養(yǎng)液沖洗1遍，加入20倍A體積的所述雙抗培養(yǎng)液,然后在CO₂培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12小時；

（3）取完成步驟（2）的培養(yǎng)體系，吸棄除貼壁細胞以外的液體，用所述雙抗PBS緩沖液沖洗3遍，然后用所述雙抗培養(yǎng)液沖洗1遍，加入20倍A體積的所述雙抗培養(yǎng)液,然后在CO₂培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12小時；

所述培養(yǎng)液為含體積比為10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；

所述雙抗培養(yǎng)液為含100μg/1ml青霉素和100μg/1ml鏈霉素的所述培養(yǎng)液；

所述雙抗PBS緩沖液為含100U/1ml青霉素和100μg/1ml鏈霉素的pH7.4、0.01M的PBS緩沖液。

所述方法還可包括步驟（4），即取完成步驟（3）的培養(yǎng)體系，吸棄上清液，用所述雙抗PBS緩沖液沖洗3遍，然后用所述雙抗培養(yǎng)液沖洗1遍，用0.05%Trypsin-EDTA消化，離心棄上清，得到細胞沉淀，將細胞沉淀的體積定義為B體積；加入20倍B體積的所述雙抗培養(yǎng)液，然后在CO₂培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48小時。

所述細胞液可為鼻咽癌細胞株5-8F的細胞液、鼻咽癌細胞株C666-1的細胞液或食管鱗癌細胞系TE8的細胞液。

細胞活力=活細胞濃度/總細胞濃度*100%。

本發(fā)明選取遭受輕度污染的三種貼壁腫瘤細胞作為處理對象，其生長狀態(tài)不良主要表現(xiàn)在細胞計數(shù)少、細胞活力弱、細胞貼壁情況不良（傳代6h后仍多懸浮、細胞小且透明度差，可見游離雜質(zhì)）。本發(fā)明的目的是將雜質(zhì)除去恢復細胞活性。本發(fā)明提供的方法的步驟如下：（1）將輕度污染的細胞液首先經(jīng)過兩次5s轉(zhuǎn)速100g的離心，初步將細胞核游離雜質(zhì)分離；然后經(jīng)10s轉(zhuǎn)速500g離心，經(jīng)一步分離細胞；然后將細胞沉淀靜置于雙抗培養(yǎng)液30s后棄去上清，初步除去殘留污染物，再以雙抗培養(yǎng)液充分吹打制成細胞懸液，3000g離心120s，棄上清，再次除去殘留的污染物，加入雙抗培養(yǎng)液并吹打，制成細胞懸液，加適量雙抗培養(yǎng)液后置于CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6h；（2）吸棄除貼壁細胞以外的液體，用雙抗PBS緩沖液沖洗3遍，再以雙抗培養(yǎng)液沖洗1遍，加入適量的雙抗培養(yǎng)液后置于CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)12小時，本步驟是進一步去除可能的污染物，經(jīng)過上述處理在倒置顯微鏡下可以看到：細胞貼壁情況良好、透光率好（細胞圓而亮）、外形緊湊、生長均勻，提示細胞活性恢復；（3）吸棄除貼壁細胞以外的液體，用雙抗PBS緩沖液沖洗3遍，然后以雙抗培養(yǎng)液沖洗1遍，進一步減少污染幾率，如此處理過的細胞可以進行傳代。傳代培養(yǎng)24h后與復蘇的相應凍存細胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)24h后，在細胞計數(shù)、細胞活力及細胞形態(tài)等方面進行比較無差異，表明此種對輕度污染細胞的處理方法可以恢復細胞活性，完成細胞傳代。

附圖說明

圖1為TGC/5-8F細胞液和CG/5-8F細胞液中細胞的照片（400×）。