[發明專利]一種葡萄白粉病菌的單孢分離方法

有效

• 申請號: 201310259691.2
• 申請日: 2013-06-26
• 公開（公告）號: CN103320376A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 張瑋;燕繼曄;李興紅;劉梅;周瑩;嚴紅
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;王慧鳳

技術領域

本發明涉及一種生物病菌的單孢分離方法，具體涉及一種專性寄生的葡萄白粉病菌的單孢分離方法。

背景技術

葡萄白粉病（Grape?Powdery?Mildew）是一種世界性的真菌病害，其病原為葡萄白粉病菌Erysipher?necator?Schw.[syn.Uncinula?necator(Schw.)Burr.,]，屬于子囊菌門，核菌綱，白粉菌目，白粉菌科，白粉菌屬（Gadoury?D?M.,Cadle-Davidson?L.,Wilcox?W?F.,et?al.Grapevine?powdery?mildew(Erysiphe?necator):a?fascinating?system?for?the?study?of?the?biology,ecology?and?epidemiology?of?an?obligate?biotroph.Moleular?Plant?Pathology,2012,13(1):1-16.）。此病害分布于世界上所有種植葡萄的國家和地區（Reisch,B.I.,Pratt?C.1996.Grapes,p.297–369.In:J.Janick?and?J.N.Moore?(eds.).Fruit?breeding.Vine?and?small?fruit?crops.vol.2.Wiley,New?York.Gadoury?D?M.,Seem?R?C.,Ficke?A.,et?al.Ontogenic?Resistance?to?Powdery?Mildew?in?Grape?Berries.Phytopathology,2003,93(5):547-555.），嚴重影響著葡萄的產量、樹勢和果實品質（Gadoury?D?M.,Seem?R?C,Pearson?R?C.,et?al.Effects?of?powdery?mildew?on?vine?growth,yield,and?quality?of?concord?grapes.Plant?Disease,2001,85:137-140.Pool?R?M,Pearson?R.C.,Wesler?M?J,et?al.Influence?of?powdery?mildew?on?yield?and?growth?of?rosette?grapevines.Plant?Disease,1984,68:590-593.）。

病原菌的單孢分離是真菌病害研究的基本技術，廣泛應用于真菌的遺傳變異、生理生化特性和菌種的純化與保存工作中。目前常用的單孢分離方法有：瓊脂平板稀釋法（方中達.植病研究方法（3版）.北京:中國農業出版社,1998:137-139.Choi?Y?W,Hyde?K?D,Ho?W?H.Single?spore?isolation?of?fungi.Fungal?Diversity,1999,3:29-38.），印痕移取單孢子分離法（趙寧.印痕移取單孢子分離法.植物保護,1988,14(1):48-49.），小玻片單孢子分離法（王國良.介紹一種改進的單孢分離技術－小玻片注射法.植物保護,1986,12(3):43.），連續變倍體視顯微鏡單孢分離法（張書建,何月秋.介紹一種簡單的真菌單孢子分離法.云南農業大學報,2003,18(3):315-316.）等。但由于葡萄白粉病菌是一種專性寄生菌，需要從活體的寄主組織中獲取必要的養分，無法在合成培養基上生長，上述方法并不適用于葡萄白粉病菌的單孢分離。因此若要深入開展葡萄白粉病菌的研究，開發一種簡便易行、成功率高的適用于此病菌的單孢分離方法迫在眉睫。

發明內容

本發明的目的是提供一種易于操作且成功率高的葡萄白粉病菌的單孢分離方法。

為達到上述目的，本發明采取的葡萄白粉病菌的單孢分離方法技術方案，包括下述步驟：

1）取兩個培養皿疊放在一起，用打孔器在上面培養皿的皿底和下面培養皿的皿蓋上同一位置打孔，在下面的培養皿中加入滅菌的超純水得到雙層培養皿裝置（圖1）；

2）用細毛刷刷掉葡萄白粉病葉上白粉病菌產生的分生孢子，然后將葉片放入步驟1）中疊放的雙層培養皿裝置中，其中葉片葉面向上置于雙層培養皿裝置的上層培養皿中，葉柄從預先打好的孔插入下層培養皿，同時保證葉柄浸入超純水中；

3）把步驟2）中放入葉片的雙層培養皿裝置于22℃，光照周期為10-14小時/天的培養箱中培養10-14天；