[發明專利]基于數字微鏡元件的全反射顯微鏡環形掃描方法和裝置

有效

• 申請號: 201310257782.2
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103364345A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 匡翠方;郝翔;李旸暉;劉旭
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/01
• 分類號: G01N21/01;G02B21/06;G02B26/10;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于微觀觀測測量領域，具體涉及一種基于數字微鏡元件的全反射顯微鏡環形掃描方法和裝置。

背景技術

顯微鏡泛指可以將微小不可見或難見物品的影像放大，使其能夠被肉眼或其他成像儀器觀察的工具。作為顯微鏡家族中最早出現也是最為龐大的一支，光學顯微鏡通常由幾個透鏡或透鏡組加上必要的機械結構組合而成，對于生物、醫學、材料等領域的發展具有十分重要的推動作用。隨著科學技術的進步，光學顯微鏡日趨專門化，出現了針對某些特殊應用領域的專門顯微鏡產品和技術。在這些產品之中，全內反射熒光顯微鏡（total?internal?reflection?fluorescent?microscope，TIRFM）由于具有極低的背景光噪聲而被廣泛應用于細胞表面物質的動態觀察。其基本原理是利用光線全反射后在介質另一面產生倏逝波的特性，激發熒光分子以觀察熒光標記樣品的極薄區域，觀測的動態范圍通常在200nm以下。因此，全內反射熒光顯微鏡具有很好的切片觀察效果。

然而，熒光分子具有很強的分子極性，因此，其熒光受激發射響應表現出很強的偏振和方向選擇性。這種特異選擇性對于入射激發光提出了較高的要求，如處理不當，很容易造成觀察圖像的失真。在全內反射熒光顯微鏡中，為了克服上述問題，通常要求從全內反射顯微物鏡出射的激發光能夠以觀察區域為中心繞系統光軸旋轉，從而實現全角度的全反射照明，進而避免圖像失真。常規的作法是使用一個二維振鏡組配合一個大口徑透鏡將入射激發光聚焦在全內反射顯微鏡物的后焦面上并使其繞光軸環狀掃描，進而達到全角度的全反射照明的目的。這種作法對于二維振鏡組的控制電路要求極高，不僅要求其具有很高的同頻和響應速度，同時其輸出波形也非常復雜。因此，全內反射熒光顯微鏡中掃描模塊往往設計復雜。即便如此，現有的掃描模塊仍具有功能單一、通用性不足等技術缺陷。

發明內容

為了克服現有技術的不足，同時降低制造成本，本發明提供了一種基于數字微鏡元件的全反射顯微鏡環形掃描方法和裝置。

一種基于數字微鏡元件的全反射顯微鏡環形掃描方法，包括以下幾個步驟：

1）在數字微鏡元件上建立環形圖像掃描序列，所述的環形圖像掃描序列為依次顯示在數字微鏡元件上的圖像，且所有圖像圍成一個環形；

2）激發光通過均勻、擴束處理后入射至數字微鏡元件，然后經數字微鏡元件上的圖像顯示區域反射并通過全內反射顯微物鏡照射至樣品上；

3）根據所述的環形圖像掃描序列，完成對樣品的環形掃描。

在步驟1）中，首先根據全內反射熒光顯微鏡的掃描速度、成像面深度和系統所用激發光的波長參數，在數字微鏡元件上生成環形圖像掃描序列。環形掃描圖形序列，是指一系列依次顯示的圖像，每一幀圖像顯示形狀完全相同，對應于一個圓環區域上對應于圓環圓心張角相同的片斷，在位置上沿角向依次排布，將所有圖像疊加上能夠形成一個完整的圓環，圓環半徑由成像面深度和系統所用激發光的波長參數決定，圖形序列刷新頻率由系統掃描速度決定。

在所述的步驟2）中，所述的激發光為單色圓偏振光，其波長和輸入功率由標記樣品的熒光染料的性質決定。

所述的數字微鏡元件，其圖像分辨率應至少為1024像素×768像素，圖像刷新率應至少達到10000幀/秒，優選為德州儀器(TI)的4100。

在步驟2）中，入射至數字微鏡元件的光束與所述數字微鏡元件反射的光束的光軸夾角為24度。數字微鏡元件上的反射鏡傾斜角度為10～12°，在反射鏡傾斜12°時，入射光與反射光的光軸夾角為24度。

本發明的工作原理是：

為了實現全內反射熒光顯微鏡中激發光的環形掃描，需要將激發光聚焦在全內反射顯微物鏡的后焦面上并使其在后焦面上勻角速度做環形移動才可以實現。為了達到上述效果，可以利用成像透鏡使數字微鏡元件與全內反射顯微物鏡后焦面呈光學共軛位置，并控制數字微鏡元件所顯示的圖形信息。當數字微鏡元件所顯示的圖形信息與預期的環形掃描光斑移動軌跡完全重合時，即可以通過該模塊實現預期的環形掃描功能。理論上，在后焦面上光斑的環形運動軌跡半徑應于全內反射顯微物鏡的入瞳半徑相等。但是，由于在實際系統中全內反射顯微物鏡不可避免存在色差，因此，為了使得不同波長（顏色）的激發光在樣品表面上滿足齊焦條件，需要對于環形運動軌跡半徑進行微調。因滿足成像關系，這種微調可以通過調整數字微鏡元件上所顯示環形掃描圖形序列圖像的半徑來實現。當激發光波長（顏色）不變時，通過相同的微調處理，則可以改變出射激發光的全反射角，從而實現對于樣品的縱向掃描。