[發明專利]一種與臨床原因不明的NOA相關的線粒體DNA SNP標志物及其應用

有效

• 申請號: 201310256853.7
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103290006A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 夏彥愷;陸春城;吳煒;秦玉峰;杜桂珍;許妙斐;王心如
• 申請（專利權）人: 夏彥愷
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;劉成群

發明領域

本發明屬于基因工程及生殖醫學領域，涉及一種與臨床原因不明的NOA（非梗阻性無精子癥）相關的線粒體DNA?SNP標志物及其應用。?

背景技術

全世界約有8－15%的育齡夫婦具有不同程度的生育障礙，其中男方因素約占50%。研究表明，半個多世紀以來，人類精液質量顯著下降，目前認為精子生成障礙的發生是一個多因素、多階段的過程，是環境危險因素（外因）和個體遺傳因素（內因）共同作用的結果。其中，個體遺傳因素包括染色體遺傳因子改變、表觀遺傳修飾異常及線粒體基因組遺傳結構變異。線粒體基因組作為核外唯一的基因組，其遺傳結構變異被認為是男性不育最重要的遺傳病因之一。?

線粒體DNA（mitochondrial?DNA,mtDNA）存在于線粒體胞漿中，較核基因組DNA具有相當程度的獨立性。人類mtDNA是16569bp（GenBank登錄號NC_012920）的閉環核外基因，包括富含鳥嘌呤的重（H）鏈和富含胞嘧啶的輕（L）鏈，有37個基因負責編碼細胞中13個蛋白質亞基，22種轉運RNA（tRNA）和兩種核糖體RNA（rRNA），12S和16S的tRNA基因為線粒體蛋白質的合成所需，這13個蛋白質亞基都是呼吸鏈酶復合物的亞單位，包括復合物I（NADH-Q還原酶）、復合物Ⅱ7亞基（ND1到ND6以及4L）、復合物III（細胞色素b）、細胞色素氧化酶3亞基（COXI、COX?II和COX?III）、復合物IV和復合物V（ATP酶6和8亞基），與細胞核DNA編碼復合物Ⅱ一起參與氧化磷酸化。與核基因不同，線粒體DNA無內含子，所有編碼序列是連續重疊的，mtDNA中任何突變都會累及基因組中的重要功能區域。此外，線粒體缺少組蛋白或DNA捆綁蛋白保護，且復制快速，無有效的校正讀碼和DNA修復機制，因此其突變率高于核DNA的10-100倍。哺乳動物精子細胞尾部中段含有約72-80個線粒體，線粒體是精子中唯一的細胞器，為精子生成提供ATP，精子線粒體在精子生成方面起到了十分重要的作用。?

目前，非梗阻性無精子癥（NOA）的初步診斷方法主要為病史詢問、體格檢查、?精液參數、精漿生化、血性激素檢測、B超以及染色體檢測等。世界衛生組織在男性不育的診斷檢查及處理手冊指明：無精子癥是指精子密度等于0，即使將精液離心后檢查亦不能發現精子。臨床上通常3次離心鏡檢精液仍未見到精子，同時，排除不射精和逆行射精后方可確診為無精子癥病人。常規的精子密度分析目前主要依靠精子密度判別（人工計數或利用計算機輔助系統分析，即CASA），尚無其他有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，如個體精液質量波動較大，尤其易受到禁欲天數、溫度、采集精液方法等因素的影響，從而造成精子密度測量不準確；對相應疾病的早期診斷效果也遠不能滿足需要。而明確診斷常需進行睪丸穿刺活檢，這給尋求生育幫助的人群帶來極大的痛苦。盡管目前國內外研究者正努力探索新的NOA診斷生物標志物，并對現有評估手段進行有效的補充，但一直難以突破傳統生物標志物發展和男性生殖實際應用中的瓶頸，即有創穿刺活檢、精液質量分析結果波動、以及早期診斷困難等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治療手段，大多數NOA病人只能選擇ICSI或AID等輔助生育手段，不僅無法滿足心理上的要求，而且有可能出現后代的遺傳缺陷。?

研究表明，遺傳因素是引起男性不育的主要因素，線粒體遺傳變異在其中起重要作用。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。遺傳變異的存在被認為賦予了個體不同的表型性狀，以及對于環境暴露、藥物治療等因素的不同反應性，因此遺傳變異可能是導致個體對常見疾病發病和預后易感性差異的重要遺傳基礎。利用疾病易感的遺傳變異譜對相關疾病進行輔助診斷，不僅靈敏、準確和快速，具有廣闊的應用前景。目前還沒有將線粒體DNA遺傳變異應用于NOA診斷的報道，若能篩選出NOA易感的線粒體DNA遺傳變異作為生物標志物，并研制相應的診斷試劑盒，對NOA的診斷現狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟了新的途徑。?

發明內容

本發明的目的是針對上述技術問題，提出一種與臨床原因不明的NOA相關的線粒體DNA?SNP標志物。?

本發明的第二個目的是提供上述SNP標志物的特異性引物。?

本發明的第三個目的是提供上述SNP標志物的特異性熒光探針對。?

本發明的第四個目的是提供上述SNP標志物及其特異性引物和/或特異性熒光探針在制備臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒中的應用。?

本發明第五個目的是提供臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒。?