[發明專利]一種合成胸腺法新的方法

有效

• 申請號: 201310256576.X
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103497245A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 肖慶;劉建;馬亞平;袁建成
• 申請（專利權）人: 深圳翰宇藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 深圳市深佳知識產權代理事務所(普通合伙) 44285
• 代理人: 唐華明

技術領域

本發明涉及醫藥合成領域，具體涉及一種合成胸腺法新的方法。

背景技術

胸腺法新（Thymosinα1，也稱胸腺肽α1）是胸腺素主要的生物活性成分，為體內重要的免疫調節物質，是N端乙酰化的28個氨基酸組成的多肽，其肽序如下：

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly?s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH

本品治療慢性乙型肝炎和增強免疫系統反應性的作用機制雖尚未完全闡明，但多項體外試驗顯示，本品通過刺激外周血液淋巴細胞絲裂原來促進T淋巴細胞的成熟，增加抗原或絲裂原激活后T細胞分泌的干擾素α、干擾素γ以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同時增加T細胞表面淋巴因子受體水平。本品還可通過對CD4細胞的激活，增強異體和自體的人類混合淋巴細胞反應。本品可能增加前NK細胞的聚集，而干擾素可使其細胞毒性增強。體內試驗顯示，本品可以提高經刀豆蛋白A激活后小鼠淋巴細胞白介素2受體的表達水平，同時提高白介素2的分泌水平。

目前胸腺法新制備工藝有基因工程法（如CN1431311）和固相合成法（如CN102199205），其中基因工程法因工藝繁瑣、三廢多的不利因素不如固相合成法應用普遍。專利CN102199205公開了一種多肽胸腺法新的合成方法，其采用逐個偶聯的合成方式。然而，用逐個偶聯法在制備胸腺法新的過程中，合成周期長，雜質較多（在長肽的合成中容易產生缺省肽等雜質），大部分雜質和目的多肽相似導致后續的純化難以進行，收率和純度無法達到較高水平。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種合成胸腺法新的方法，使得本發明所述方法能夠提高其純度和合成重量收率。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種合成胸腺法新的方法，包括以下步驟：

步驟1、固相合成在SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列在Lys側鏈上、Glu側鏈上偶聯有保護基且在C端偶聯有樹脂的多肽樹脂1；

固相合成在SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列N端、Ser側鏈上、Glu側鏈上、Thr側鏈上、Lys側鏈上、Asp側鏈上偶聯有保護基的多肽片段1；

固相合成在SEQ?ID?NO:3所示氨基酸序列N端偶聯有乙酰基、在Ser側鏈上、Thr側鏈上、Asp側鏈上偶聯有保護基的多肽片段2；

步驟2、將多肽片段1的C段與多肽樹脂1的N端進行偶聯反應獲得多肽樹脂2；

步驟3、脫去多肽樹脂2的N端保護基并與多肽片段2的C段進行偶聯反應獲得多肽樹脂3，加入裂解液去除多肽樹脂3的樹脂以及所有保護基得到胸腺法新粗品；

步驟4、胸腺法新粗品微濾、RP-HPLC純化后獲得胸腺法新純品。

其中，作為優選，步驟2和步驟3所述偶聯反應以HOBt/DIC雙試劑偶聯體系、PyBOP/HOBt/DIPEA三試劑偶聯體系或HBTU/HOBt/DIPEA三試劑偶聯體系進行偶聯。進一步優選地，步驟2所述偶聯反應以HBTU/HOBt/DIPEA三試劑偶聯體系進行偶聯，步驟3所述偶聯反應以PyBOP/HOBt/DIPEA三試劑偶聯體系進行偶聯；

步驟2和步驟3所采用的偶聯體系各偶聯試劑之間的摩爾比優選為：

PyBOP:HOBt:DIPEA為1:1:2，HBTU:HOBt:DIPEA為1:1:2，HOBt:DIC為1:1。

作為優選，步驟3所述裂解液為體積比TFA：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水為80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液。

作為優選，步驟2和步驟3所述偶聯反應以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一種或兩種以上為溶劑，其中，作為進一步優選方案，步驟2和步驟3均為體積比DMF：DMSO為1:1的混合溶劑。

作為優選，步驟1所述固相合成多肽樹脂1為：

步驟A1、Fmoc-β-Asp（OtBu）-OH在偶聯體系作用下與氨基樹脂進行偶聯反應得到Fmoc-β-Asp（OtBu）-氨基樹脂；

步驟A2、脫除Fmoc保護基得到H-β-Asp（OtBu）-氨基樹脂，Fmoc-Glu（OtBu）-OH在偶聯體系作用下與H-β-Asp（OtBu）-氨基樹脂進行偶聯反應得到Fmoc-Glu（OtBu）-β-Asp（OtBu）-氨基樹脂；