[發(fā)明專利]一種鄰苯二酚半乳糖苷的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310255797.5
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN103276029A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧麗麗;肖敏;郭玉川
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/44
• 分類號(hào): C12P19/44
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鄰苯二酚糖苷衍生物的制備方法，特別涉及一種利用β-半乳糖苷酶突變酶合成鄰苯二酚半乳糖苷的方法，屬于糖工程技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

酚類化合物是一類帶有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，具有多種生理學(xué)和藥理學(xué)功能，如兒茶酚具有抗氧化作用、Avarol能抑制HIV的復(fù)制等。酚類化合物的糖基化不僅可以增加水溶性，還能改進(jìn)藥理學(xué)性質(zhì)和療效。例如：對苯二酚具有毒性，而對苯二酚-α-葡萄糖苷(熊果苷)則具有抗菌和皮膚增白效果；子丁香酚由于抑制5α-還原酶而具有修護(hù)頭發(fā)的功能，但其易升華，有特殊氣味，化學(xué)法糖基化形成的子丁香酚-β-葡萄糖苷能被頭皮上存在的微生物緩慢代謝，逐漸降解釋放酚類結(jié)構(gòu)，有利于藥效的發(fā)揮。可以說，新的酚類化合物糖苷具有新的藥理學(xué)性質(zhì)，不同糖基化修飾的酚類化合物性質(zhì)不同，例如對苯二酚半乳糖苷抗氧化活性比熊果苷增高了1.19倍。

鄰苯二酚是一種精細(xì)化學(xué)品的基本原料，廣泛用于農(nóng)藥、香料、醫(yī)藥、染料、聚合物等行業(yè)，市場潛力巨大。目前鄰苯二酚衍生物的開發(fā)多采用化學(xué)法，酶法衍生化僅有一例相關(guān)報(bào)道，采用α-葡萄糖苷酶對帶有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的兒茶酚化合物進(jìn)行葡萄糖基修飾，尚無鄰苯二酚的酶法半乳糖基修飾報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鄰苯二酚半乳糖苷的制備方法。

一種鄰苯二酚半乳糖苷的制備方法，包括如下步驟：

（1）采用磷酸緩沖液配制乳糖濃度為0.1M～0.3M，鄰苯二酚濃度為0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量為2μg～10μg/mL的反應(yīng)體系；

（2）將步驟（1）制得反應(yīng)體系于37～45℃水浴中反應(yīng)20～60分鐘，煮沸終止反應(yīng)，10000～12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液；

（3）將步驟（2）制得的上清液，經(jīng)分離、干燥后，制得鄰苯二酚半乳糖苷。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1）中氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的β-半乳糖苷酶選用GenBank登錄號(hào)為ACE06986.1，將第980位色氨基酸用苯丙氨酸取代，制得。取代后的β-半乳糖苷酶可按照發(fā)表文獻(xiàn)[Synthesis?of?galactosyl?sucralose?byβ-galactosidase?fromLactobacillus?bulgaricus?L3,Food?Chem,2012,134:269-275]所述方法制備酶蛋白。上述β-半乳糖苷酶對鄰苯二酚具有顯著轉(zhuǎn)糖基活性。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1）中的磷酸緩沖液為濃度10～100mM，pH6～8的磷酸鉀緩沖溶液；根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（1）中的緩沖液為50mM，pH7.0的磷酸鉀緩沖液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2）中的反應(yīng)條件為45℃水浴反應(yīng)45分鐘。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2）中的煮沸終止反應(yīng)條件為100℃煮沸5分鐘。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3）中的分離采用制備型薄層層析板分離，型號(hào)Silica?gel60F254(Merck,Germany)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3）中的干燥為冷凍干燥。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（3）中還包括分離時(shí)的薄層層析檢測，合并遷移距離相同的產(chǎn)物的步驟。

上述薄層層析檢測的步驟如下：

薄層層析板點(diǎn)樣后在展層劑中展開，霧噴顯色劑后，于120℃烘烤5分鐘使糖斑點(diǎn)顯色。

上述展層劑由正丁醇、無水乙醇和水按體積比5：3：2混合配制；顯色劑是體積百分比為20%的硫酸和濃度為0.5wt%的3,5-二羥基甲苯的溶液。

有益效果

本發(fā)明以鄰苯二酚為原料，以廉價(jià)乳糖底物為半乳糖基供體，采用經(jīng)過突變的β-半乳糖苷酶合成鄰苯二酚半乳糖苷，產(chǎn)物與其原料鄰苯二酚相比，含有半乳糖基，增加了水溶性和穩(wěn)定性。該化合物自身可作為一種化學(xué)合成中間體，用以衍生合成新的高附加值化合物，在化工、醫(yī)藥等各方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為鄰苯二酚半乳糖苷的質(zhì)譜圖；

圖2為鄰苯二酚半乳糖苷的氫譜；

圖3為鄰苯二酚半乳糖苷的氫氫相關(guān)核磁圖譜；

圖4為鄰苯二酚半乳糖苷的碳?xì)渲苯酉嚓P(guān)核磁圖譜；

圖5為鄰苯二酚半乳糖苷的碳?xì)溥h(yuǎn)程相關(guān)核磁圖譜。