[發(fā)明專利]一種殺松材線蟲的工程菌及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310255508.1
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103289947A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃天培;林群新;關(guān)雄;張靈玲;吳昌標(biāo);錢小莉;鄭穎;沙莉;黃響珠;周勇;林燕珍;戴瑞卿
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A01N47/44;A01P5/00;C12R1/19
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域???

本發(fā)明涉及一種工程菌及其應(yīng)用，具體涉及一種殺松材線蟲的工程菌及其應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

松材線蟲?[Bursaphelenchus?xylophilus（Steiner?&?Buhrer）Nickle;?pine?wood?nematode，PWN]?屬于線蟲動(dòng)物門、線蟲綱、墊刃目（Aphelenchida）、滑刃總科、滑刃科（Aphelenchoidedae）、傘滑刃線蟲屬（Bursaphelenchus）。PWN兼有噬菌特性和取食樹體內(nèi)薄壁細(xì)胞的功能，可導(dǎo)致素有松樹“癌癥”之稱的松材線蟲病，是世界四大森林病害之一，同時(shí)也是我國一種主要的外來入侵生物病害。它嚴(yán)重危害我國松林安全，能危害8種非松屬植物和36種松屬植物。由于松材線蟲病能使多種松樹迅速死亡，危害嚴(yán)重，防治極其困難，國內(nèi)外給予高度的重視，很多國家一直將其作為有害生物檢疫對象。松材線蟲病最早在日本長崎發(fā)現(xiàn)，到2009年，松材線蟲病已傳播到北美（加拿大，美國和墨西哥）、歐洲（葡萄牙）和亞洲（日本，韓國和中國），已成為松樹林和森林生態(tài)系統(tǒng)的一種世界性的威脅。2003年，松材線蟲病殺死了日本大約10×10⁵立方米的松樹。我國于1982年首次在南京中山陵的黑松上發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，短短三十幾年來，該病疫情由1省1市1區(qū)傳播到粵、魯、皖、浙、鄂、渝、桂、滬、閩、湘、黔、滇、贛的l4個(gè)省市區(qū)及臺灣和香港地區(qū)，2004年已傳播到四川的鄰水。松材線蟲病具有致病能力強(qiáng)、傳播迅速、寄主死亡的速度快，防治難度大等特點(diǎn)，不僅具有危害方面的嚴(yán)重性與毀滅性，而且具有治理方面的艱巨性與長期性，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于松材線蟲病的嚴(yán)重危害性，一旦發(fā)生就很難控制，所以目前在松材線蟲病的防治方面還是實(shí)行“以防為主，防治結(jié)合，防重于治”的方針。另外，由于松材線蟲病的致病機(jī)理還沒有厘清，所以至今松材線蟲病的防治仍然面臨許多難題。因此，鑒于目前防治PWN策略中存在的弊病，有必要開發(fā)新的可持續(xù)抗PWN策略。?

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus?thuringiensis,?Bt）是一種革蘭氏染色陽性（G+）細(xì)菌，屬于芽胞桿菌屬中的一個(gè)種，在土壤中廣泛存在。它有別于其他芽胞桿菌的特征是在細(xì)菌產(chǎn)生芽胞的過程中，會在菌體的一端或兩端形成具有蛋白性質(zhì)的伴胞晶體。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個(gè)目3000多種害蟲有活性。從20世紀(jì)60年代人們發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲晶體蛋白對線蟲有特異活性以來，國外研究者們開展了大量有關(guān)這方面的研究，克隆出了抗線蟲的相關(guān)基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Bt對PWN也有一定的殺滅作用，但Bt對PWN的研究卻一直沒有深入進(jìn)行，Bt生防潛力沒有得到充分的發(fā)掘。?

因此，通過以松材線蟲為靶標(biāo)，獲得高效殺松材線蟲的Bt殺蟲晶體蛋白，不僅可以廣辟資源，擴(kuò)大Bt的防治譜，而且可以減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染，具有顯著的生態(tài)效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種殺松材線蟲的工程菌及其應(yīng)用。?

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案如下：?

本發(fā)明的一種殺松材線蟲的工程菌是人工構(gòu)建的含Bt殺松材線蟲晶體蛋白基因cry1E的工程菌，宿主為大腸埃希氏菌（Escherichia??coli），于2013年5月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，菌株保藏號為：CGMCC?NO：7661；對殺松材線蟲具有活性。

本發(fā)明的一種殺松材線蟲工程菌（CGMCC?NO：7661）的構(gòu)建方法，包括以下步驟：?

（1）菌株的篩選：在市場購買來的大量Bt菌株中，篩選出殺松材線蟲活性最強(qiáng)的Bt菌株，對其殺蟲晶體蛋白進(jìn)行殺松材線蟲毒力的測定，并對該殺蟲晶體蛋白進(jìn)行質(zhì)譜測序和基因克隆。

（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-cry1Ea11：以含cry1Ea11基因的Bt菌株DNA為模板，設(shè)計(jì)一對cry1Ea11引物cry1EF和cry1ER，克隆獲得一個(gè)5’端含BamH?I位點(diǎn)和3’端含Sal?I酶切位點(diǎn)的3528?bp的cry1Ea11.。引物cry1EF和cry1ER的序列如下：?

cry1EF：5'-CGGGATCCATGGAGATAGTGAATAATCAGAATC-3'