[發(fā)明專利]一種C3H10T1/2 中胚層多潛能胚胎干細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310254446.2
• 申請日: 2013-06-24
• 公開（公告）號: CN103361307A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 寧光;張曉燕;楊穎
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0735
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方法，特別涉及一種C3H10T1/2中胚層多潛能胚胎干細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化方法。?

背景技術(shù)

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高、生活壓力的不斷加大、人們飲食結(jié)構(gòu)的改變、運動量的減少，導(dǎo)致肥胖癥的患病率迅速上升，據(jù)估計目前全世界超重或肥胖人口約達(dá)10億。肥胖癥作為代謝綜合征的主要組分之一，與多種疾病如2型糖尿病、血脂異常、高血壓、冠心病密切相關(guān)，嚴(yán)重危害人類的健康，影響和困擾著人們的日常生活。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬在肝臟和脂肪組織的脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮著重要作用，自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，藉此實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。所以，自噬現(xiàn)象為肥胖癥的治療提供了新的思路。?

小檗堿是一種異喹啉類生物堿，是中藥黃連的主要成分，以往研究已經(jīng)證實小檗堿具有很多藥理作用包括抗菌，抗腫瘤，能夠抑制炎癥因子TNF-α、IL-6等的表達(dá)尤其是在肥胖的個體有明顯的抗炎癥作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠降血糖，改善胰島素抵抗作用。?

C3H10T1/2細(xì)胞系是在1973年，首次從14到17天的C3H小鼠胚胎細(xì)胞分離出來，這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞形態(tài)，在功能上類似于間充質(zhì)干細(xì)胞，如能把C3H10T1/2誘導(dǎo)定向分化成前脂肪細(xì)胞，然后再按照標(biāo)準(zhǔn)的分化誘導(dǎo)方案分化為成熟脂肪細(xì)胞,表現(xiàn)出脂肪的特性，然后再應(yīng)用C3H10T1/2成熟脂肪細(xì)胞來研究小檗堿對自噬的影響，監(jiān)測成熟脂肪細(xì)胞中自噬對脂質(zhì)代謝的調(diào)控，為肥胖癥的治療提供新的藥物靶點和治療方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種C3H10T1/2中胚層多潛能胚胎干細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化方法，通過該方法，將C3H10T1/2細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，表現(xiàn)為甘油三酯的蓄積和脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，使C3H10T1/2細(xì)胞能很好地運用到后續(xù)小檗堿抑制C3H10T1/2脂肪細(xì)胞自噬方面的研究實驗中，為臨床上能更合理的將小檗堿應(yīng)用于肥胖患者的治療提供依據(jù)。?

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：?

一種C3H10T1/2中胚層多潛能胚胎干細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化方法，其步驟包括：?

（1）、培養(yǎng)與傳代：將C3H10T1/2細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)液中，并置于5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80％-90％融合后加入0.25%胰酶5mL消化，細(xì)胞收縮呈圓形時加入培養(yǎng)液終止胰酶消化反應(yīng)，離心3-5分鐘、沉淀、棄去上清，再加入培養(yǎng)液后吹打；按1：4比例傳代培養(yǎng)到6孔板或12孔板，置于5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-4天更換培養(yǎng)液1次。優(yōu)選的，每2天更換培養(yǎng)液1次。?

（2）、誘導(dǎo)分化：待步驟（1）中的培養(yǎng)板上的細(xì)胞長滿后置于誘導(dǎo)液A中，2天后撤去誘導(dǎo)液A換成誘導(dǎo)液B，2天后撤去誘導(dǎo)液B換成培養(yǎng)液，每2-4天更換培養(yǎng)液1次，待90%以上細(xì)胞呈圓形并出現(xiàn)大量脂滴，即表示C3H10T1/2細(xì)胞已誘導(dǎo)成功。優(yōu)選的，每2天更換培養(yǎng)液1次。?

所述步驟（1）或步驟（2）中的培養(yǎng)液為含有體積百分比為10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。?

所述步驟（1）中，5％CO₂的培養(yǎng)箱的培養(yǎng)溫度為35℃-40℃。優(yōu)選的，5％CO₂的培養(yǎng)箱的培養(yǎng)溫度為37℃。?

所述步驟（2）中，誘導(dǎo)液A為含有體積百分比為10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中還含有胰島素4-5μg/mL，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5-0.7mmol/L，地塞米松1-2μmol/L，吲哚美辛120-130nmol/L,三碘甲狀腺氨酸1-2nmol/L，羅格列酮1-2μmol/L。優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)液A為含有體積百分比為10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中還含有胰島素5μg/mL，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5mmol/L，地塞米松1μmol/L，吲哚美辛125nmol/L,三?碘甲狀腺氨酸1nmol/L，羅格列酮1μmol/L。?

所述步驟（2）中，誘導(dǎo)液B為含有體積百分比為10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中還含胰島素5-10μg/ml，三碘甲狀腺氨酸1-3nmol/L，羅格列酮1-3μmol/L。優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)液B為含有體積百分比為10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中還含胰島素5μg/ml，三碘甲狀腺氨酸1nmol/L，羅格列酮1μmol/L。?