[發明專利]一種檢測低含量基因突變的PCR擴增方法及其應用

無效

• 申請號: 201310254151.5
• 申請日: 2013-06-24
• 公開（公告）號: CN103305617A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 王東;李賓;梁旺;張濤
• 申請（專利權）人: 基因科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種檢測低含量基因突變樣本中基因突變的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以待測基因為模板，以分別互補于突變位點上游和下游的一對擴增引物進行PCR擴增，同時加入覆蓋突變位點的抑制性寡核苷酸，

其中，所述抑制性寡核苷酸的特征是：

(a)序列中相應于待測突變位點的堿基位于寡核苷酸的中部；

(b)5’或3’端附近位置存在1-4個與野生型基因中相應堿基不配對的堿基，其它堿基與野生型基因中相應堿基配對；

(c)其3’末端缺少形成磷酸二酯鍵的羥基；

其中，所述擴增引物中，一條引物位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游，且其3’端有2-10個堿基與所述抑制性寡核苷酸的5’端2-10個堿基互補于野生型基因模板上相同的位置；另一條引物位于所述抑制性寡核苷酸3’端下游，且其與所述抑制性寡核苷酸互補于野生型基因模板上不同的位置；和

(2)對(1)的PCR擴增產物進行序列分析和/或序列鑒定，確定待測基因是否發生突變。

2.一種從低含量基因突變樣本中富集突變基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

以待測基因為模板，以分別互補于突變位點上游和下游的一對擴增引物進行PCR擴增，同時加入覆蓋突變位點的抑制性寡核苷酸，

其中，所述抑制性寡核苷酸的特征是：

(a)序列中相應于待測突變位點的堿基位于寡核苷酸的中部；

(b)5’或3’端附近位置存在1-4個與野生型基因中相應堿基不配對的堿基，其它堿基與野生型基因中相應堿基配對；

(c)其3’末端缺少形成磷酸二酯鍵的羥基；

其中，所述擴增引物中，一條引物位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游，且其3’端有2-10個堿基與所述抑制性寡核苷酸的5’端2-10個堿基互補于野生型基因模板上相同的位置；另一條引物位于所述抑制性寡核苷酸3’端下游，且其與所述抑制性寡核苷酸互補于野生型基因模板上不同的位置；和

(2)獲得PCR擴增產物，其中富集了突變基因。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)的(b)中，所述的5’或3’端附近位置是：從5’或3’末端堿基起算，第2-6個堿基處；和/或

步驟(1)中，所述抑制性寡核苷酸的長度10-40bp；較佳地為15-35bp；更佳地為20-30bp。

4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)的(c)中，在3’末端進行化學修飾，使之缺少形成磷酸二酯鍵的羥基；較佳地，所述的化學修飾包括：3’磷酸化、3’氨基化、3’巰基化，熒光標記；更佳地為3’磷酸化修飾。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，抑制性寡核苷酸與野生型基因模板的解鏈溫度、位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的擴增引物的解鏈溫度、抑制性寡核苷酸與突變型基因模板的解鏈溫度依次降低。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，抑制性寡核苷酸與野生型基因模板的解鏈溫度優選為58-62℃；和/或

所述的抑制性寡核苷酸與突變型基因模板的解鏈溫度比所述的抑制性寡核苷酸與野生型基因模板的解鏈溫度低6℃或6℃以上；較佳地低10℃或10℃以上；和/或

所述的位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的擴增引物的解鏈溫度比所述的抑制性寡核苷酸與野生型基因模板的解鏈溫度低1-4℃；較佳地低1-3℃。

7.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴增包括變性、引物退火和引物延伸的循環過程；在適當的退火溫度條件下，抑制性寡核苷酸優先結合野生型基因模板，導致位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的擴增引物的3’端無法與野生型基因模板結合，從而抑制野生型基因的擴增；抑制性寡核苷酸與突變型基因模板不能結合，突變型基因正常擴增；較佳地，所述的適當的退火溫度為：位于所述抑制性寡核苷酸5’端上游的擴增引物的解鏈溫度、抑制性寡核苷酸與突變型基因模板的解鏈溫度之間的溫度。

8.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述序列分析和/或序列鑒定方法包括：Sanger測序法、焦磷酸測序法、新一代測序法、熒光PCR法、基因芯片檢測、膜雜交檢測。

9.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因突變包括：點突變、缺失突變或插入突變。

10.權利要求1-9任一所述的檢測低含量基因突變樣本中突變基因的方法在基因突變檢測中的應用。