[發明專利]磁性Fe3O4@SiO2-NH2納米微球固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145的方法

無效

• 申請號: 201310254078.1
• 申請日: 2013-06-24
• 公開（公告）號: CN103333879A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 孫謐;徐甲坤;盛軍;鄭鴻飛;劉均忠;琚彩霞
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 史和初;楊小蓉

技術領域

本發明涉及海洋微生物領域，特別是涉及磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂納米微球固定化海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145的方法。?

背景技術

脂肪酶（EC3.1.1.3），是一類主要催化細胞內外甘油和長鏈脂肪酸水解、酯合成反應的羧基水解酶，是一種通過反應將底物降解形成游離脂肪酸和甘油的界面酶。它屬于一類水解酶（E.C.3），作用于羧酸酯（E.C.3.1）的酯鍵(E.C.3.1.1)上，能夠水解甘油三酯，甘油二酯和甘油單酯，并稱為三酰甘油酰基水解酶（E.C.3.1.1.3）。脂肪酶的催化反應范圍廣泛，能夠催化進行包括水解，酯交換，醇解，酸解，酯化和氨解在內的多種生物化學反應。脂肪酶對多種底物都能夠起到區域選擇性合成、對映體催化的作用。?

海洋環境中嗜冷微生物所產生的脂肪酶，在低溫下能夠高效的進行催化水解反應，而普通的嗜溫微生物在低溫條件下僅能表現出很少的活性。這些脂肪酶在結構功能上具備更高的靈活性，特別是其活性位點的特殊性賦予了低溫脂肪酶低活化焓，低底物親和力和低溫下的高比活性。?

游離酶催化反應是在溶液中進行的，一般來說穩定性差，容易失活、不溶于有機溶劑，易受環境等因素的影響。固定化酶是通過適當的方法將酶固定在一定的空間內，在保持其自身特性的同時能夠實現回收和重復利用。固定化酶的出現解決了游離酶實際應用中的諸多局限，游離酶穩定性較差,脂肪酶分離純化困難等問題，限制了海洋脂肪酶的利用。?

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術存在諸多不足，經發明人長期開發研究海洋微生物及其酶產物和生產實踐,開發提供一種固定化體系穩定，酶活率保留高的磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂納米微球固定化海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145的方法。?

本發明提供的磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂納米微球固定化海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145的方法,包括下列步驟：?

將磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂納米微球置于容器（如西林瓶）中，再向容器中加入酶蛋白濃度為0.0375一0.225mg/ml、pH4.0-10.0的海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145溶液,在搖床上進行固定化反應,固定化反應溫度為20-50℃,固定化反應時間為4-20小?時，然后進行磁性分離，收集上清液，用于測定蛋白含量，清洗固定化海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145，直至清洗液中無蛋白含量吸收，得固定化海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145。?

本發明提供的磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂納米微球固定化海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145的方法中,所述海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145（海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145的編號以區別其它低溫堿性脂肪酶,下文簡稱脂肪酶Bohai?Sea-9145或脂肪酶）是由適冷性海洋酵母菌株Bohai?Sea-9145發酵培養產的脂肪酶,是一種海洋低溫脂肪酶。該海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145對于中長鏈的酯類底物有較強的水解作用，在低溫環境中能夠保持較好的脂肪酶活性，同時作用pH和溫度范圍較廣，顯示出良好的酶學特性。?

所述適冷性海洋酵母菌株Bohai?Sea-9145是從渤海海域海泥中分離獲得的高產低溫堿性脂肪酶Bohai?Sea-9145（海洋脂肪酶Bohai?Sea-9145）的適冷性海洋酵母菌株Bohai?Sea-9145，根據第四版《The?Yeasts,A?Taxonmic?study》，（Kurtzman&Fell,1998）確定為適冷性海洋解脂耶羅氏酵母菌株（Yarrowia?lipolytica?strain）一個新的亞種，該適冷性海洋酵母菌株Bohai?Sea-9145于2003年11月26日保藏于中國武漢中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC），保藏號為CCTCCNO：M203095。?