[發明專利]一種雙酶偶聯制備β-丙氨酸的方法

無效

• 申請號: 201310253952.X
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103320480A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 焦慶才;劉均忠;毛娉婷;劉茜
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

?一、技術領域

???本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種雙酶法制備β-丙氨酸的方法。

二、背景技術

β-丙氨酸是合成泛酸的前體，泛酸是B族維生素的一種，構成輔酶A的一部分，對于各種組織內的內源代謝能量交換都很重要。隨著對β-丙氨酸認識的逐漸加深，β-丙氨酸在醫藥、食品、化妝品、飼料等領域應用日益廣泛，對β-丙氨酸的市場需求也在不斷增長，因此β-丙氨酸具有廣泛的應用前景和開發價值。

目前根據文獻報道β-丙氨酸的制備方法主要有化學合成法和生物酶法。

1、化學合成法

化學合成法有丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亞胺（丁二酞亞胺）降解法、β-氨基丙腈法，雙氰乙基胺法。其中β-氨基丙腈法和丙烯腈法原料價格便宜，但中間產物水解后分離比較困難，特別是β-丙氨酸與副產物分離比較復雜，水解過程生成大量無機鹽。該方法的工藝條件要求苛刻，且易發生其它副反應，工業化生產和環保治理難度大，生產成本高。

Buc等以丙烯腈與氨水發生氨化反應生成β-氨基丙腈，在酸性或堿性條件下水解，經分離制備β-丙氨酸。

2、生物酶法

（1）腈降解酶

川利洋等利用產有機腈降解酶的微生物催化β-氨基丙腈水解合成β-丙氨酸，微生物Alcaligenes?sp.?OMT-MY14，Achromobatrer?xerosis?IF012668，??Pseodonocardia?thermophila?ATCC19285，AminoBacter?aminobrance?ATCC23314能夠催化β-氨基丙腈水解，其中Alcaligenes?sp.?OMT-MY14催化效果最佳，在30℃，其游離細胞在緩沖液中催化1.0%?β-氨基丙腈水解反應1?h，β-丙氨酸濃度達到47?mmol/L。

田脅新一郎等利用微生物如Micrococcus?lysodeikticus?ATCC4698、Micrococcus?luicus?ATCC12698、Corynebacrerium?glutamscum?ATCC21253等轉化β-氨基丙醇，30℃反應30?h，β-丙氨酸濃度達4.0?mg/mL。

（2）天冬酸氨酸-α-脫羧酶

天冬氨-α-脫羧酶酶法生產工藝是以L-天冬氨酸為原料、脫羧酶為催化劑的一步生化反應，其設備簡單、反應條件溫和、酶活力高、反應速度快、專一性強。脫羧酶法生產β-丙氨酸已成為近年來人們關注和研究的方向。

Wiliamson（J.?Biol.?Chem.?1979,?254:?8074-8082）等以微生物濕菌體或粗酶液為酶源，以L-天冬氨酸為底物，0.1?mol/L磷酸鉀緩沖液（pH?7.5），于42℃酶促轉化，反應20?min，得到含β-丙氨酸的反應液，經分離提取制得β-丙氨酸，天冬氨酸-α-脫羧酶Km值約為160?μmol/L。

Cronan（J.?Biol.?Chem.?1980,?141(3):?1291-1297）以微生物濕菌體或粗酶液為酶源，以L-天冬氨酸為底物，0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH?6.8），于37℃酶促轉化，反應1～2?h得到含β-丙氨酸的反應液，經分離提取制得β-丙氨酸，天冬氨酸-α-脫羧酶Km值約為80?μmol/L。

洪敏等（浙江工業大學學報,?2011,?39(3):?252-256）以L-天冬氨酸為底物，以天冬氨酸-α-脫羧酶基因工程菌（pET-28c(+)-panD）酶法合成了β-丙氨酸，酶活達到186?U。

高麗娟（浙江工業大學碩士學位論文,?2007）以L-天冬氨酸為底物，以天冬氨酸-α-脫羧酶基因工程菌（pET-21c(+)-panD）酶法合成了β-丙氨酸，酶活達到224.96?U。

三、發明內容

本發明需要解決的問題是提供一種高效、低成本的直接以富馬酸銨為原料雙酶法制備β-丙氨酸的方法。本發明以富馬酸銨為原料，以天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶雙酶偶聯制備β-丙氨酸。

本發明可以通過以下技術方案來達到：

β-丙氨酸的雙酶法轉化制備方法，其步驟為：

（1）分別將具有天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶活性的菌株，在培養基中培養產生高活性的天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶；