[發明專利]一種快速檢測水產品中甲基睪丸酮的膠體金試劑板

無效

• 申請號: 201310253312.9
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103308699A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 王偉萍;王揚;吳光紅;張美琴;吳茂生;黃奕雯;桑麗雅;胡葉軍;邵偉;陳笑笑
• 申請（專利權）人: 杭州南開日新生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種快速檢測甲基睪丸酮的膠體金試劑板，具體涉及一種快速檢測水產品中甲基睪丸酮的免疫膠體金快速檢測試劑板。

背景技術

甲基睪丸酮(methyltestosterone，MT)是一種合成類固醇，屬于蛋白同化激素，具有雄性和蛋白同化雙重作用。但其在水產品中的殘留嚴重威脅人體健康。大量實驗表明，甲基睪酮代謝時間長，對人類的危害是慢性、遠期和累積性的。其危害主要表現在干擾體內自然激素的平衡、使正常人的生理功能發生紊亂，嚴重時還會致新生兒畸形，影響兒童的正常生長發育。

歐盟95/22/EC規定禁止使用雄性激素獸藥，美國也規定其同類的丙酸睪酮在肌肉中的最高殘留限量(MRL)為0.64μg/kg，我國2001年由農業部實施的行業標準《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》(NY5070-2001)中，將甲基睪酮列為禁用藥物。2002年發布的農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定甲基睪酮為禁止使用獸藥，在所有食用動物的所有可食組織中不得檢出。

目前國內外水產品中激素殘留分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜測定法(LC-MS)等，其特點在于準確性高、靈敏度高、重復性好，然而，這些方法需要較長的實驗時間及相應昂貴的實驗設備，難以滿足現代檢測快速、簡捷、現場化的要求，不適于大規模樣本篩查。

膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術的基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術，該方法將反應所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應通常只需數分鐘至數十分鐘，檢測結果以肉眼可見的顯色條帶來判讀。此法具有簡便快速、操作簡單、特異性強、不需要額外設備等優點。

發明內容

本發明的目的是克服現有檢測技術存在的缺陷，研制開發一種檢測限符合要求，重現性好，適用于現場快速篩檢水產品中甲基睪丸酮殘留的免疫膠體金快速檢測試劑板。

本發明的另一目的是提供該試劑板的制備方法。

本發明的再一目的是提供該試劑板的應用。

所述試劑板應用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應顯色，特異性檢測水產品中的甲基睪丸酮殘留。如果樣品溶液含有殘留，甲基睪丸酮先和膠體金顆粒上的抗體反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的甲基睪丸酮占據而無法與檢測線上甲基睪丸酮特異性抗原結合；當樣品中的甲基睪丸酮含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較質控線淺甚至無顯色，判定為陽性。相反，當樣品中甲基睪丸酮含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與質控線相近或偏深，判定為陰性。

所述試劑板由上下兩塊塑料模板、背襯和背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊組成。在樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰的地方有2mm±0.5mm的重疊，一方面是為了保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應時間，樣品墊上的緩沖體系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結合墊上的金標抗體順利發生反應。

所述試劑板的各部分組成成分與功能如下：

塑料模板，起固定試紙條及標示功能區(加樣孔、檢測區、質控區)的作用。

背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。

樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液pH值的作用。

膠體金結合墊由聚酯膜制成，其上包被有膠體金標記的抗甲基睪丸酮單克隆抗體，是樣品溶液中的有效成分與金標抗體發生反應的場所。

硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向依次包被有甲基睪丸酮-牛血清白蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質控線，主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。

吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多余的溶液吸收。

所述試劑板的制備方法，包括如下步驟：

(1)甲基睪丸酮-載體蛋白偶聯物的制備：將甲基睪丸酮MT與載體蛋白牛血清白蛋白BSA和卵清蛋白OVA分別進行偶聯制備包被抗原MT-BSA和免疫抗原MT-OVA；

(2)抗甲基睪丸酮單克隆抗體的制備：按照常規方法使用免疫抗原MT-OVA免疫制得抗甲基睪丸酮單克隆抗體；

(3)使用檸檬酸三鈉法制得平均大小為40nm的膠體金溶液；