[發(fā)明專利]一株黃曲霉生防菌的抗菌活性物質(zhì)及其分離純化方法

有效

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• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN104178543B
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦文;劉丁;張志清;葉勁松;李瑩露
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P21/00
• 分類號(hào): C12P21/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C12R1/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗菌活性物質(zhì)，尤其涉及來源于萎縮芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，屬于微生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

眾所周知，微生物能夠產(chǎn)生具有抗細(xì)茵、抗真菌和抗病毒等作用的抗菌活性物質(zhì)。至今為止, 青霉菌類細(xì)菌產(chǎn)生的青霉素、頭孢霉屬產(chǎn)生的頭孢菌素、鏈霉菌屬產(chǎn)生的鏈霉素、 四環(huán)素及紅霉素等作為抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)得到了廣泛的利用。

然而，由于這些抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)長年使用，因此普遍導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)這些抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生了耐受性，因此急需尋找新的、更加強(qiáng)有力的新型抗菌活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的需要，本發(fā)明提供了一種新型的、具有良好抗菌、抑菌活性的抗菌活性物質(zhì)，該抗菌活性物質(zhì)來源于萎縮芽孢桿菌，本發(fā)明還提供了此種抗菌活性物質(zhì)的分離純化方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請發(fā)明人多年來對(duì)各種桿菌進(jìn)行了廣泛研究，并發(fā)現(xiàn)從土壤中分離得到的萎縮芽孢桿菌經(jīng)過培養(yǎng)能夠得到對(duì)細(xì)菌，尤其是黃曲霉菌具有極好的抑制效果，基于此發(fā)現(xiàn)申請了完成了本發(fā)明。

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

萎縮芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，所述活性物質(zhì)來源于下述制備方法所制備：將萎縮芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上進(jìn)行搖床培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心收集上清液，將所得上清液用過濾器過濾，即為包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液。

可以理解，本發(fā)明并不僅限于上述的抗菌活性物質(zhì)，還包括包含上述抗菌活性物質(zhì)的商業(yè)成品，例如抗菌劑，可以通過常規(guī)的制造方法將本發(fā)明的抗菌活性物質(zhì)與醫(yī)藥學(xué)上已知的容許的適當(dāng)醫(yī)藥栽體組合形成制劑，此類商業(yè)產(chǎn)品通常是包含食品和清潔用品的抗菌劑，例如用于化妝水、乳液、洗面奶、護(hù)膚劑、面膜、化妝油、防曬劑、木材、紙張、油性漆、布、粘合劑、涂裝保護(hù)劑、食品保鮮劑 (含飲料) 、糖果、甜餅、零食等點(diǎn)心和輔助食品、 清涼飲料等飲料和食品中，具體的用量可以根據(jù)已有藥學(xué)知識(shí)通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)得到。

在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了所述抗菌活性物質(zhì)的制備方法，包括下述步驟：1）將萎縮芽孢桿菌菌種接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)即得發(fā)酵液；2）將發(fā)酵液低溫下高速離心，收集上清液，用0.45um微型過濾器過濾，即為包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液。

通過上述步驟可以得到本發(fā)明的抗菌活性物質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所得到的上清液并非純度為100%的抗菌活性物質(zhì)，而是包含該抗菌活性物質(zhì)的溶液，在經(jīng)過更復(fù)雜的分離純化后才能得到高純度的抗菌活性物質(zhì)。該物質(zhì)含量濃度的高低只會(huì)影響用量，而不會(huì)影響單位含量物質(zhì)的效力。

在上述方法中，萎縮芽孢桿菌的接種培養(yǎng)條件可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，申請人在大量研究中得出了較為優(yōu)選的培養(yǎng)條件：接種量：1-5%；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基裝液量：15-100mL/250mL；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基初始pH值：5.0-9.0；培養(yǎng)溫度：10-50℃；培養(yǎng)時(shí)間：12-60h；培養(yǎng)所用搖床轉(zhuǎn)速：10-240r/min。

在上述培養(yǎng)條件下，所得上清液表現(xiàn)出一定的抗菌抑菌活性。

申請人對(duì)上述的條件進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)能有效提高抗菌活性物質(zhì)的抑菌性能。

更優(yōu)選的，所述步驟1）的培養(yǎng)條件為接種量：1.5%；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基裝液量：30mL/250mL；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基初始pH值：7.0；培養(yǎng)時(shí)間：48h；培養(yǎng)所用搖床轉(zhuǎn)速：180r/min。

在上述培養(yǎng)條件下，所得到的抗菌活性物質(zhì)具有最佳的抑菌活性。

為了提高接種效率，在進(jìn)行接種培養(yǎng)以前，將萎縮芽孢桿菌菌種接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)，加入無菌水以旋渦混合儀振蕩使菌體均勻分布。

優(yōu)選的，萎縮芽孢桿菌菌種接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48h，所加入的無菌水含0.1%吐溫-80和0.1%瓊脂。

在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明還公開了對(duì)所得上清液進(jìn)行分離純化的步驟，從而得到高純度的萎縮芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)純化物，該分離純化方法包括下述步驟：1）將包含抗菌活性物質(zhì)的去菌體發(fā)酵上清液進(jìn)行粗提，粗提方法為硫酸銨沉淀法；2）包含抗菌活性物質(zhì)的粗提物進(jìn)行層析分離純化，包括脫鹽得到富集包含抗菌活性物質(zhì)的洗脫液和將脫鹽所得洗脫液進(jìn)行離子交換層析將所得流出液收集、合并，濃縮得到萎縮芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)純化物的步驟。

優(yōu)選的，上述步驟1）采用硫酸銨沉淀法：將發(fā)酵上清液加入硫酸銨固體粉末至80%飽和度硫酸銨，離心收集沉淀。