[發(fā)明專利]真核生物翻譯起始因子4H（eIF4H）基因沉默抑制腫瘤細胞生長的方法及其應用

有效

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• 申請日: 2013-06-21
• 公開（公告）號: CN103421792A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設計）人: 張世馥;薛建有;桑婷婷;戚武林;朱曉芳;張辛皎;趙輔昆
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/867;C12N1/21;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京三高永信知識產(chǎn)權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 何文彬

技術領域

本發(fā)明涉及一種新型的抑制腫瘤細胞生長的方法，該方法能夠在體外抑制小鼠血癌細胞的生長。該方法為白血病的發(fā)生和細胞分化機理的研究提供了新的視角，為抗腫瘤藥物的研究提供了潛在的靶點。?

背景技術

白血病是一類嚴重的血液惡性腫瘤，在各類癌癥中發(fā)病率較高。研究表明白血病的發(fā)生是造血祖細胞分化和凋亡紊亂所致。正常造血祖細胞程序性分化過程是受到一系列因子的嚴格調(diào)控，如果造血祖細胞失去了對調(diào)控因子的正常應答，就可能會引起細胞去分化和增殖失控。?

利用基因沉默的方法可在mRNA和蛋白質(zhì)水平降低目的基因表達，從而下調(diào)腫瘤發(fā)生相關的一些基因的異常表達來達到治療腫瘤的目的。真核生物翻譯起始因子4H(eukaryotic?translation?initiation?factor4H，eIF4H)是一個核糖體的翻譯起始蛋白，可促進的蛋白質(zhì)的合成。而對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控往往與細胞增殖、分化乃至腫瘤的發(fā)生密切相關，因此eIF4H是一個潛在抗腫瘤的治療靶點。?

eIF4H在進化過程中具有高度的保守性，對基因和蛋白質(zhì)同源性的研究發(fā)現(xiàn)人和鼠的亞型II的同源性分別為91.4%和99.1%。eIF4H通過選擇性的剪接5位外顯子產(chǎn)生兩個蛋白亞型，亞型Ⅰ含248個氨基酸，約27kDa，亞型Ⅱ含228個氨基酸，約25kDa，在小鼠中兩個亞型的表達量相近。eIF4H通過調(diào)控cyclin?D1的表達來促進細胞增殖。在常見人腫瘤細胞中，eIF4H均有較高表達。?

慢病毒介導的RNA干擾技術可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，高效持久的實現(xiàn)特定基因的下調(diào)表達。含有干擾序列的慢病毒質(zhì)粒載體可在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定表達小發(fā)夾結構的shRNA，shRNA在細胞內(nèi)進一步加工成siRNAs，從而干擾目的基因，造成RNA水平上的基因沉默。?

本發(fā)明構建了針對eIF4H的RNA干擾質(zhì)粒，通過與兩個慢病毒包裝質(zhì)粒共轉染人腎胚細胞293T細胞獲得可使eIF4H低表達的慢病毒，慢病毒侵染鼠紅白血病細胞MEL細胞系，?有效抑制了血癌細胞的生長，并可促進紅系分化進程。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以真核生物翻譯起始因子4H（eIF4H）為靶基因，利用慢病毒介導的RNA干擾技術使該基因沉默，創(chuàng)建了一個有效的抑制體外腫瘤細胞生長的方法。?

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)eIF4H在丁酸鈉或六甲基烯二乙酰胺（HMBA）誘導MEL細胞紅系分化過程中表達下調(diào)。在eIF4H基因的編碼區(qū)選取翻譯起始位點后的第179～199bp作為干擾靶位點，合成了可形成小發(fā)夾shRNA的寡聚核苷酸序列，通過分子生物學方法獲得了含有該shRNA的真核干擾質(zhì)粒。將干擾質(zhì)粒與兩個病毒包裝質(zhì)粒共同轉染入人腎胚細胞293T細胞系以獲得可使eIF4H低表達的慢病毒。然后將慢病毒侵染鼠紅白血病MEL細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定株。蛋白質(zhì)印跡分析技術顯示，干擾細胞株中eIF4H蛋白表達量明顯下降，表明eIF4H基因被有效的沉默了。通過MTT分析，發(fā)現(xiàn)低表達eIF4H的MEL細胞的生長速度明顯低于對照組；利用流式細胞術分析了細胞周期，結果顯示MEL細胞在eIF4H基因沉默后S期細胞減少，G₁期細胞增多；利用聯(lián)苯胺染色對紅系分化進行分析，eIF4H低表達促進MEL細胞紅系分化進程。以上三個實驗結果表明eIF4H基因沉默后，MEL細胞的增殖受到抑制。?

本發(fā)明提出的技術路線可以進一步應用于不同組織來源的腫瘤細胞和不同的腫瘤相關基因，可以用來研究腫瘤的發(fā)生機制，尋找用于抗腫瘤的基因治療的理想靶點。?

附圖說明：

下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述。?

圖1：eIF4H在丁酸鈉或HMBA誘導MEL細胞紅系分化過程中表達下調(diào)；?

圖2：本發(fā)明中選擇的干擾靶位點；?

圖3：eIF4H基因沉默MEL細胞穩(wěn)定株的建立；?

圖4：eIF4H基因沉默后MEL細胞的生長速度明顯低于對照組；?

圖5：eIF4H基因沉默后MEL細胞中S期細胞減少，G₁期細胞增多；?

圖6：eIF4H基因沉默后促進了MEL細胞的紅系分化進程。?

下面將通過借助以下實施例來更詳細地說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的，應該明白，本發(fā)明并不受下述實施例的限制。?

具體實施方式

在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。?

實施例1?

免疫印跡法檢測eIF4H在丁酸鈉或HMBA處理的MEL細胞中的表達變化?