[發明專利]一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞及其應用有效
| 申請號： | 201310251408.1 | 申請日： | 2013-06-24 |
| 公開（公告）號： | CN104232585B | 公開（公告）日： | 2018-06-22 |
| 發明（設計）人： | 丁長才;湛敏 | 申請（專利權）人： | 丁長才 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/864;A61K35/44;A61P39/06;A61P39/02 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 518055 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 金屬硫蛋白基因 臍帶間充質干細胞 攜帶 重組腺相關病毒 制備 重組腺相關病毒載體 衰老模型小鼠 模型小鼠 衰老進程 小鼠血 滴度 構建 小鼠 血鉛 質粒 延緩 感染 應用 | ||
1.一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：
(1)將人金屬硫蛋白基因連接到腺相關病毒載體pAAV-MCS上，得到攜帶金屬硫蛋白基因的重組腺相關病毒載體pAAV-MCS-hMT，鑒定金屬硫蛋白基因已連接到腺相關病毒載體上；
(2)利用磷酸鈣共沉淀法將重組腺相關病毒載體pAAV-MCS-hMT、包裝質粒pAAV-RC、輔助質粒pHelper共轉染到AAV-293細胞中，培養至AAV-293細胞出現表型變化和毒性反應,完成重組腺相關病毒株rAAV-hMT的包裝；
(3)收集細胞懸液，采用反復凍融方法，收集含有重組腺相關病毒株rAAV-hMT的上清液，純化并測定rAAV-hMT毒株的滴度；
(4)重組腺相關病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質干細胞，得到攜帶有金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞；
所述人金屬硫蛋白基因經EcoR I和Xho I雙酶切后插入pAAV-MCS,構成重組腺相關病毒載體pAAV-MCS-hMT；
所述步驟(4)重組腺相關病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質干細胞的步驟為：將重組腺相關病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代對數生長期臍帶間充質干細胞培養液中，5％CO2，37℃細胞培養箱培養24小時。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)獲得重組腺相關病毒株rAAV-hMT的步驟為：收集細胞懸液輪流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰凍和37℃水浴箱中融化，反復凍融4次，每次10分鐘，室溫下10000g轉速離心10分鐘，收集上清液，純化并測定毒株滴度。
3.根據權利要求1或2所述的制備方法得到的攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞在制備治療衰老或由氧自由基、重金屬Cd2+和鉛導致的疾病的制品中的應用。
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