[發明專利]一種利用自然界中分離出的微生物制備龍腦的方法

無效

• 申請號: 201310249414.3
• 申請日: 2013-06-22
• 公開（公告）號: CN103290065A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 盧文清
• 申請（專利權）人: 安徽濟民醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P7/02
• 分類號: C12P7/02;C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C12R1/22
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技術領域

本發明涉及一種龍腦的制備方法，尤其是一種從自然界中分離出的能催化蒎烯轉化生成龍腦的微生物，并利用其制備龍腦的方法。

背景技術

我國是松節油和桉葉油等萜烯精油資源大國。近年，我國取消了松節油等天然精油原油的出口退稅。這一政策的實施，有力地推進了天然精油手性化合物等高附加值產品的產業化進程。但是生產常采用硫酸、硼酐等作為催化劑，易燃易爆；草酸、醋酐為酯化劑，生產過程污染狀況嚴重。因此，國內外很多研究人員，寄希望能從自然界微生物中分離出的能催化蒎烯轉化生成龍腦的微生物，用于工業生產。

1994年，南京林業大學采用一株自行分離篩選得到的桔青霉NFU-901及其誘變株UV(O1)對a-蒎烯進行生物轉化，發現a-蒎烯的轉化產物主要是馬鞭草烯醇（75%），而龍腦的含量只有2.4%和4%；2008年，廣西大學劉幽燕等用特氏克雷伯氏菌(klebsiella?planticola)菌株SM08411.?ZJ0802A?1和E0802a和2%蒎烯作用生成乙酸龍腦酯，乙酸龍腦酯在微生物作用下，進行水解反應可獲龍腦，但是該工藝耐受底物濃度低，主要用于乙酸龍腦酯微生物轉化制龍腦，工業利用價值低?。

蒎烯是化學法合成龍腦時應用最廣泛的原料。而以蒎烯為原料進行生物轉化可以制備龍腦，說明自然界的微生物中存在能催化蒎烯轉化生成龍腦的微生物。但是從現有文獻報道中可以發現，龍腦往往只是作為轉化產物中的一個副產物，因此產量都較低。若能尋找到能夠專一性或選擇性轉化蒎烯生成龍腦的微生物，則以豐富的蒎烯為原料，通過生物轉化的方法制備龍腦的產率將會大大地提高。

發明內容

本發明正是針對現有技術存在的不足，提供一種利用自然界中分離出的微生物制備龍腦的方法。

為解決上述問題，本發明所采取的技術方案如下：

一種利用自然界中分離出的微生物制備龍腦的方法，所述方法依次包括以下步驟：

步驟一：菌種的篩選與鑒定

原始菌株篩選：從自然界中取富含松節油的土壤和松樹皮、葉樣品，將分離得到的各純菌株分別接種到經滅菌處理，盛有100份查氏培養基液的容器中，于30℃，150r/min條件下搖瓶培養48h，然后各加入2%蒎烯，在相同條件下發酵培養30h后，用氣相色譜儀分析發酵產物情況，以乙酸龍腦酯為目標物對比選出最為理想的菌株作為試驗菌株；富集培養結束后，取培養液1mL用無菌水依次稀釋至10倍、5倍、10倍、6倍后涂布平板，待菌落生長后，挑取不同的菌落進行平板劃線分離純化，并保藏純化的單菌落菌株；

②菌株鑒定：根據菌株形態觀察及生理生化試驗結果以及16S?rDNA序列同源性分析，結合《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰細菌鑒定手冊》，確定菌株為革蘭氏陰性菌，且與植生克雷伯氏菌最相似，結合分子生物學結果，確認菌株為植生克雷伯氏菌；

步驟二：菌種的誘導變異

步驟一所得的菌種依次采用下列等離子誘導和化學亞硝基胍誘變：

等離子誘導：取10mL菌液8000rpm/min離心10min，棄去上清液，用10mL生理鹽水懸浮得菌懸液；取2ml菌懸液均勻涂布于等離子體裝置的下電極介質上，電壓24kV，電流1.7mA、間隙3mm的操作條件下照射0，10，15，20，30，50和70s，將處理過的菌液梯度稀釋后，取1ml涂布于固體培養基平板上，37℃下蔽光培養2天，用平板菌落計數法進行活菌計數，繪制致死曲線，選取致死率70%~80%對應的時間為等離子體處理時間，進行一次冷等離子誘變，照射后立即稀釋涂布在固體瓊脂培養基上，30℃恒溫下培養2天，挑選30個單菌落，進行后續化學誘變；

②化學亞硝基胍誘變：作用劑量為300~500ppm，誘變在pH5.0，0.1M的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中靜息培養3h，然后稀釋涂布在固體瓊脂培養基上，30℃恒溫下培養2天，挑選30個單菌落，從挑選的30個單菌落中，選擇3株產率最高的菌株，進行蒎烯發酵試驗，進而再從其中選擇1株產率最高的菌株；固態托盤培養制成原曲；

步驟三：龍腦的制備