[發(fā)明專利]一種來(lái)自動(dòng)物糞便宏基因組的α-淀粉酶及其基因

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310249147.X
• 申請(qǐng)日: 2013-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN103290039A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許波;黃遵錫;楊富亞;李俊俊;唐湘華;周峻沛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/56
• 分類號(hào): C12N15/56;C12N9/26;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)自動(dòng)物糞便宏基因組的α-淀粉酶及其基因。

背景技術(shù)

α-淀粉酶（EC?3.2.1.1）是一種內(nèi)切葡萄糖苷酶，能水解淀粉中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，生成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精和少量的低分子糖類，從而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以又稱為液化酶。α-淀粉酶廣泛存在于人、動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌等各種生物中，1956?年首次報(bào)道分離α-淀粉酶至今，各國(guó)研究者已經(jīng)分離并鑒定了超過(guò)120種α-淀粉酶，其中主要是來(lái)源于微生物的芽孢桿菌屬（Bacillus）、曲霉屬（Aspergillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和酵母。

由于動(dòng)物攝食種類廣泛的植物和動(dòng)物性食物，使存在其胃腸道中的微生物具備了相應(yīng)的特殊生理、代謝特點(diǎn)，能產(chǎn)生各種酶類以分解食物中的淀粉、果膠、纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)。因此，動(dòng)物胃腸道微生物本身是一個(gè)巨大的、未開發(fā)的酶基因資源庫(kù)，蘊(yùn)涵著大量潛在的酶基因資源。

然而，傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)使得占微生物種類99%以上的不可培養(yǎng)微生物無(wú)法分離獲得，尤其是腸道中的厭氧微生物可培養(yǎng)性更低，因此通過(guò)分離培養(yǎng)微生物來(lái)篩選新型酶的傳統(tǒng)方法大大限制了篩選的廣泛性和有效性。宏基因組學(xué)避開了微生物分離培養(yǎng)的問(wèn)題,?極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間，為尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因及生物催化劑——酶提供了新的研究策略。目前，研究者已利用宏基因組技術(shù)成功篩選到多個(gè)淀粉酶類基因，但研究領(lǐng)域主要集中在水體和土壤（Delavat?et?al.?Sci?Rep.2012,2:354;?Liu?et?al.?Mar?Biotechnol?(NY).2012,14(3):253-260;?Sharma?et?al.?Appl?Microbiol?Biotechnol.?2010,?86(6):1821-1828），以動(dòng)物胃腸道微生物為對(duì)象進(jìn)行的研究較少（Tasse?et?al.?Genome?Res.?2010,20:1605-1612;?Ferrer?et?al.?Biotechnol?J.?2007,2:207-213）。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新的來(lái)自動(dòng)物糞便宏基因組的α-淀粉酶。

本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述α-淀粉酶的基因。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明的另一目的是提供用所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所得的重組菌株。

本發(fā)明所述的一種來(lái)自動(dòng)物糞便宏基因組的α-淀粉酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，該基因的大小為1458bp。

本發(fā)明所述的一種α-淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2?所示，共485個(gè)氨基酸，其理論分子量為55.439?kDa。

本發(fā)明的α-淀粉酶最適作用pH為5.6，在pH?4.6-6.6之間可以保持65%以上酶活；在pH?4.0-8.0范圍內(nèi)處理1h后，酶活剩余70%以上；最適作用溫度為50℃，在37℃條件下較為穩(wěn)定，耐受50min仍保持80%以上的酶活。

本發(fā)明首先從倭蜂猴的糞便中提取制備微生物基因組DNA，然后用該DNA、fosmid載體pCC1FOS和大腸桿菌構(gòu)建了宏基因組文庫(kù)，通過(guò)功能篩選法，從文庫(kù)中篩選獲得在含淀粉底物平板上能形成透明圈、且淀粉酶活性較高的菌株Amy4-7-2。從菌株Amy4-7-2中提取fosmid質(zhì)粒，然后將該fosmid質(zhì)粒片段化后與載體PUC118連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建了亞克隆文庫(kù)，通過(guò)功能篩選從文庫(kù)中獲得能形成透明圈的菌株AmyC-1-5。從菌株AmyC-1-5中提取質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板通過(guò)PCR的方法分離克隆了α-淀粉酶的編碼基因plA。將該α-淀粉酶基因plA與質(zhì)粒pEASY-E1連接得到重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）獲得重組菌株。經(jīng)NCBI網(wǎng)站的BLAST比對(duì)，該α-淀粉酶基因編碼的氨基酸序列與GenBank中來(lái)源于人類胃腸道的Bifidobacterium?pseudocatenulatum的假想蛋白具有最高的一致性（70%）。

本發(fā)明的制備α-淀粉酶的方法按以下步驟進(jìn)行：

1）培養(yǎng)上述的重組菌株，誘導(dǎo)重組α-淀粉酶表達(dá)；

2）回收并純化所表達(dá)的α-淀粉酶。