[發明專利]一種含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針及應用

無效

• 申請號: 201310247072.1
• 申請日: 2013-06-20
• 公開（公告）號: CN103320120A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 趙寶祥;苗俊英;呂洪水;黃淑亞
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D491/107;G01N33/52;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明涉及一種pH熒光探針及應用，尤其涉及一種含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針及其作為活細胞內溶酶體pH熒光探針的應用。

背景技術

人體細胞內pH值在細胞、酶和組織活動如細胞代謝、信號傳導、細胞生長、細胞增殖、細胞凋亡、細胞自噬、多藥耐藥性、內吞作用和肌肉收縮等活動中起著非常關鍵的作用。監測活細胞內的pH值變化對于研究細胞內化途徑如吞噬作用也是很重要的。異常的細胞內pH值會使細胞功能紊亂，影響人體生理過程從而導致一些嚴重的疾病如癌癥和阿爾茨海默氏病等。

人體細胞內的pH值并不是均勻分布的。細胞質是弱堿性的，pH值約為7.2。而一些細胞器，如溶酶體和內質網，其內部pH值約為4.0-6.0，呈弱酸性。溶酶體內包含50余種酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、糖苷酶、脂肪酶、磷酸酯酶及硫酸脂酶等。溶酶體內的弱酸性環境(pH4.5-5.5)可以活化這些水解酶的功能，促進蛋白質在細胞代謝中的降解。細胞功能障礙往往與這些細胞器的異常酸化有關，特別是在細胞凋亡過程早期溶酶體內pH梯度會消失。因此監測活細胞內pH值的變化對于研究細胞功能及生理和病理過程具有重要意義。

目前用于測量細胞內pH值的方法很多，如核磁共振、微電極、吸收光譜和熒光光譜等。相比較而言，熒光光譜檢測具有靈敏度高、選擇性好、響應迅速、操作簡單等優點，而且多數情況下可以對細胞進行無損檢測。目前已開發出許多能夠在復雜生命體系中檢測陽離子、陰離子、活性氧及氨基酸等的熒光指示劑或傳感器。

羅丹明類染料具有量子產率高、摩爾消光系數大、光穩定性好、背景干擾少等優點，其衍生物作為“關-開”型熒光探針被廣泛應用于檢測各種金屬離子及生物相關物質。羅丹明類探針通常包含一個螺內酰胺或螺內酯結構。在中性及堿性溶液中，螺環結構保持不變，溶液為無色且不發熒光；在酸性溶液中，螺環結構打開，溶液呈現紅色并發出強熒光。這些性質使羅丹明衍生物非常適合用來檢測酸性pH。盡管目前已有部分報道的羅丹明類pH探針用于監測溶酶體中的pH值，但這些探針往往會引起“堿性效應”，即長時間孵化后會引起溶酶體內的pH值升高，影響監測結果。因此設計合成新型羅丹明類溶酶體pH熒光探針仍然具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種羅丹明B類pH熒光探針，可以快速響應、高選擇性、高靈敏度檢測酸性pH值并避免“堿性效應”；目的之二在于提供所述pH熒光探針的合成及其在檢測活細胞溶酶體pH值方面的應用。

本發明所述的含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針，其結構如式（I）所示：

上述含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針的合成方法是：

由羅丹明B與三氯氧磷反應生成羅丹明B酰氯，然后以三乙胺為縛酸劑，在二氯甲烷溶液中與半胱氨酸乙酯鹽酸鹽反應生成含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針，即化合物RCE。

上述合成路線反應式如下：

本發明所述的含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針作為活細胞內溶酶體pH熒光探針的應用。

其中：所述活細胞優選Hela細胞。

本發明所述含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針對H⁺響應迅速，有很高的靈敏度和選擇性，并且具有良好的可逆性。其作為活細胞內的pH熒光探針可以特異性標記溶酶體，并且在實驗條件下對細胞沒有毒性。具體測試方法及結果如下：

配制上述含半胱氨酸乙酯結構的羅丹明B類靶向溶酶體pH熒光探針在不同pH值下的溶液（乙醇/Britton-Robinson緩沖溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4,體積比），通過紫外可見分光光度法和熒光分光光度法測試其對不同pH值的響應能力。