[發(fā)明專利]抗人AFP單鏈抗體以及融合抗原肽的制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310246960.1
• 申請日: 2013-06-21
• 公開（公告）號: CN103319595A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高向東;姬曉南;馮麗亞;姚文兵;張瑜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/08;C07K19/00;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574;A61K39/395;A61K39/00;A61P35/00;A61P1/16
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1.人甲胎蛋白單鏈抗體，其氨基酸序列如SequenceNO.2所述。?

2.權(quán)利要求1所述的人甲胎蛋白單鏈抗體的編碼基因。?

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于：具有SequenceNO.1所示的核苷酸序列。?

4.含有權(quán)利要求2所述的編碼基因的重組載體。?

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：載體為大腸桿菌BL21(DE3)。?

6.權(quán)利要求1所述的人甲胎蛋白單鏈抗體的放射性標(biāo)記物。?

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的放射性標(biāo)記物，其特征在于：所述放射性標(biāo)記物為I^[3]。?

8.權(quán)利要求1所述的抗人甲胎蛋白單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟：?

a、抗人甲胎蛋白單鏈抗體的包涵體表達(dá)?

取權(quán)利要求4所述的重組載體，加入大腸桿菌BL21(DE3)，菌種劃線接種于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑選單菌落，接種于20mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，240r/min培養(yǎng)10-12h成為活化種子。取活化的種子1mL加入100ml?LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀0.6-0.8后，加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為0.4mmol/L，在37℃繼續(xù)誘導(dǎo)至5小時后離心收集菌體。菌體以10mL/g溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，置于冰浴中用超聲探頭進(jìn)行超聲波間歇破碎10min(超聲5s，間隔5s)，棄上清收集包涵體。?

b、抗人甲胎蛋白單鏈抗體包涵體的復(fù)性和純化?

上述包涵體中以10mL/g加入變性液(20mmol/L?Tris-HCl，pH8.0，10mmol/Lβ-巰基乙醇，8mol/L尿素)，10000r/min離心30min，棄沉淀收集上清液。所得上清液以1∶4比例和3mL/h的速度滴加稀釋到復(fù)性液中(20mmol/L?Tris-HC，pH8.0，1mmol/L?EDTA，2mol/L尿素，0.1mmol/L?GSSG，1mmol/L?GSH)，接著用pH7.4的PB緩沖液透析約20h，PEG-20000濃縮至1mL。采用抗E-tag親和層析法純化抗人甲胎蛋白單鏈抗體，再將抗人甲胎蛋白單鏈抗體的溶解試劑更換為中性pH的磷酸鹽緩沖液，既制得純化的抗人甲胎蛋白單鏈抗體。?

9.權(quán)利要求1所述的抗人甲胎蛋白單鏈抗體與肝癌細(xì)胞抗原肽的融合表達(dá)，其氨基酸序列如Seque?nce?NO.3所述。?

10.權(quán)利要求1所述的抗人甲胎蛋白單鏈抗體和權(quán)利要求9所述的抗人甲胎蛋白單鏈抗體與肝癌細(xì)胞抗原肽的融合蛋白在制備腫瘤診斷試劑和腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。?