[發(fā)明專利]一種多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310246024.0
• 申請日: 2013-06-20
• 公開（公告）號: CN103288965A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭方毅;姜海蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶理工大學(xué)
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/74;G01N33/577
• 代理公司: 重慶博凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50212
• 代理人: 李海華

1.一種多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法，其特征在于：首先采用多氯聯(lián)苯半抗原化學(xué)合成完全抗原，然后將完全抗原作為免疫原，通過動物免疫方法制備得到多氯聯(lián)苯單克隆抗體；

其中半抗原合成完全抗原采用碳二亞胺法，包括以下步驟：?????(1)首先配置濃度為1~3mg/100ul的半抗原TE?buffer溶液、濃度為0.2~0.5mg/100ul的牛血清蛋白TE?buffer溶液和濃度為20~40mg/100ul的碳二亞胺TE?buffer溶液；

(2)磁力攪拌下，將半抗原TE?buffer溶液加入含牛血清蛋白TE?buffer溶液中得到混合溶液，混合溶液邊震蕩邊滴加碳二亞胺TE?buffer溶液，半抗原與牛血清蛋白的反應(yīng)質(zhì)量配比為?1:0.1~1:0.5，半抗原與碳二亞胺的質(zhì)量比為1：16左右，然后將裝有三種溶液的容器放于搖床中于35-37℃條件下震蕩反應(yīng)2~4?h，反應(yīng)得到偶聯(lián)物，即完全抗原；

(3)用Sephadex柱將步驟(2)容器中反應(yīng)得到的偶聯(lián)物和未結(jié)合的半抗原小分子分離，然后將分離出來的偶聯(lián)物溶液裝入透析袋透析純化，在pH為7.?2的0.?01?mol/L?磷酸鹽緩沖液PBS中于4℃條件下透析3天，每天換液2次，去除游離小分子化合物，離心分出上清液得?PCB-BSA，經(jīng)紫外可見分光光度計掃描鑒定后，PCB-BSA偶聯(lián)物分裝后于-?20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法，其特征在于：所述多氯聯(lián)苯半抗原為二氯聯(lián)苯半抗原、三氯聯(lián)苯半抗原或四氯聯(lián)苯半抗原及具有類似結(jié)構(gòu)的多氯聯(lián)苯同族的同系物等。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法，其特征在于：所述動物免疫方法包括以下步驟：

???(1)將PCB-BSA偶聯(lián)物作為免疫原與等體積完全佐劑充分混勻，直至一小滴在水中不擴(kuò)散充分乳化后，對Balb/c小鼠進(jìn)行初次免疫注射，所用免疫原用量為50-200ug/只；每隔一段時間后以等體積的不完全佐劑乳化純化抗原進(jìn)行追加強化免疫，每次免疫一周后取靜脈血檢測抗體效價，若抗體效價達(dá)到10^-4~10^-5，與追加強化免疫同樣的方法進(jìn)行加強免疫，加強免疫后第3天后按步驟（2）進(jìn)行細(xì)胞融合；

??（2）將免疫動物脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)以10:1混合，用50%（w/v）聚乙二醇作融合劑將兩種細(xì)胞融合，融合細(xì)胞懸于20%（w/v）小牛血清的2%（w/v）HAT選擇性培養(yǎng)基內(nèi)，將融合細(xì)胞接種于Balb/c小鼠腹腔滲出細(xì)胞作滋養(yǎng)層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于質(zhì)量濃度為5%的CO₂培養(yǎng)箱中于37℃下生長；待生長達(dá)到1/4~1/3視野時，取上清液進(jìn)行篩選；融合第6~8天，融合細(xì)胞開始形成集落，計算細(xì)胞融合率，并進(jìn)行完全換液，完全換液3~5天后進(jìn)行第一次ELISA篩選，以篩選到僅與多氯聯(lián)苯-OVA陽性反應(yīng)，與BSA、OVA不反應(yīng)的孔進(jìn)行亞克??；亞克隆7~10天后再進(jìn)行單克隆孔的ELISA篩選，如此亞克隆3~5次，得到穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞；

???（3）腹水的制備及抗體類及亞類的制備：選取20~22只雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降殖烷，7d后，腹腔注射第（2）步得到的雜交瘤細(xì)胞2×10⁶細(xì)胞/只，1~2周后待Balb/c小鼠腹部顯著膨隆，處死Balb/c小鼠并取出腹水，以10000r/min離心30s，吸出上清液備用；進(jìn)行抗體的免疫球蛋白及亞類鑒定，純化抗體后，凍干保存即可。

4.根據(jù)權(quán)利要求?3所述的多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法，其特征在于：所述免疫原用量優(yōu)選?50-100ug/只，免疫時間為60~120天。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法，其特征在于：進(jìn)行強化免疫時，第一次追加強化免疫選擇首次免疫后2-4周，第一次追加強化免疫所用的免疫原的用量為首次免疫原用量的0.5-1.5倍；以后追加免疫時間間隔為1周，追加強化免疫所用的免疫原的用量為首次免疫原用量的0.5-1.5倍。