[發明專利]基于蛋白質的殼聚糖納米顆粒的制備方法及其作為核酸藥物載體的應用

無效

• 申請號: 201310245444.7
• 申請日: 2013-06-20
• 公開（公告）號: CN103357020A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 曹傲能;劉穎;王海芳;姜雨
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: A61K47/36
• 分類號: A61K47/36;A61K47/42;A61K9/16;A61K48/00;A61K31/713
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 顧勇華

技術領域

????本發明涉及一種基于蛋白質的殼聚糖納米顆粒的制備方法及其作為核酸藥物載體的應用，屬于高分子納米材料及生物化學領域。

背景技術

核酸藥物是如今研究的熱點，siRNA是一類具有多種生物學功能，長度為20至25個核苷酸長的雙鏈RNA分子。siRNA參與RNA干擾（RNAi）途徑，干擾特定基因的表達，用于基因治療。然而，由于siRNA的尺寸和帶負電的特性，導致其難以進入細胞，因此如何載帶它們進細胞始終是個難題。殼聚糖是自然界中唯一一種帶正電荷的天然堿性多糖，它存在范圍廣、廉價易得、無毒副作用、生物相容性極好、易于表面修飾、并且可生物降解，具有十分優異的生物活性，在生物醫學領域應用十分廣泛。本發明就利用一種新方法制備的殼聚糖納米顆粒，其表面帶有大量的正電荷，通過靜電吸附核酸藥物，將核酸藥物成功載帶進入細胞。由于殼聚糖極好的生物學特性，因此該納米顆粒是一種生物安全性極好的理想的核酸藥物載體，這對于核酸類藥物的研發具有重要的意義。?

本發明的實施案例中制備了包裹十分常見且廉價的牛血清白蛋白（BSA）的殼聚糖納米顆粒，并在其表面吸附siRNA，這種方法制備的納米顆粒尺寸很小（20nm左右），具有很大的比表面積，分散性穩定性很好，并且表面帶有大量正電荷（Zeta電勢約?+38mV），可以在其表面吸附大量的siRNA藥物，使得siRNA成功載帶進入細胞。?

目前的技術僅僅是利用乳化交聯或者復凝聚法等傳統方法制備殼聚糖納米顆粒，制備的顆粒粒徑很大，有些甚至達到微米級別，這樣納米顆粒的分散性和穩定性都不好，也不能長期存放，不然會發生嚴重的團聚；而且未經過處理的殼聚糖在生理條件下只是略微帶正電荷（pKa=6.5），對RNA的吸附力不強，吸附量也不夠。

發明內容

核酸藥物是如今研究的熱點，它能參與RNA干擾（RNAi）途徑，干擾特定基因的表達，用于基因治療。然而，由于siRNA的尺寸和帶負電的特性，導致其難以進入細胞，因此如何載帶它們進細胞始終是個難題。殼聚糖是一種生物安全性很好的天然高分子材料，用殼聚糖納米顆粒作為核酸藥物的載體是目前研究的熱點，但是目前的技術都是利用乳化交聯或者復凝聚法等制備殼聚糖納米顆粒，其制備的顆粒粒徑很大，有些甚至達到微米級別，這樣納米顆粒的分散性和穩定性都不好，也不能長期存放，不然會發生嚴重的團聚。

根據現有技術存在的缺陷，本發明的目的是利用一種新方法制備的殼聚糖納米顆粒作為核酸藥物載體的應用，該載體生物安全性好，可以吸附任何序列的siRNA，對核酸藥物的研發起了十分重要的作用。該發明具有以下過程和步驟。

a.?將殼聚糖完全溶解于酸性溶液中進行質子化，后用乙醇將其沉淀出來研磨烘干待用。蛋白質加入到pH值7.0-10.0、10-50mM的緩沖溶液中，?加入上述質子化殼聚糖，殼聚糖中氨基葡萄糖單元與蛋白質的摩爾比為2000:1-10000:1，室溫攪拌完全溶解后，加入戊二醛水溶液，戊二醛與氨基葡萄糖單元的摩爾比為0.35：1-0.7:1，室溫攪拌至反應完全后，超濾洗滌三次（3000g，15min）以除去未反應的殼聚糖等，即可得包裹蛋白質的殼聚糖納米顆粒。

b.?RNA的載帶：取上述殼聚糖納米顆粒（NPs）與RNA在室溫下混合均勻，與Hela細胞共培養6-48h，納米顆粒的終濃度為10-200μg/mL，RNA終濃度為10-200nM，即質量比為0.06%?-26.6%（RNA/NPs）。

與現有技術相比，本發明具有如下突出優點：

本發明的利用一種新方法制備的殼聚糖納米顆粒吸附RNA，該方法得到了一種蛋白質-殼聚糖核殼結構的納米顆粒，尺寸很小（20nm左右），具有很大的比表面積，分散性穩定性很好，并且表面帶有大量正電荷（Zeta電勢約?+38mV），可以在其表面吸附大量的siRNA，并載帶siRNA成功進入細胞。?

附圖說明

????圖1為本發明所得殼聚糖納米顆粒（包裹BSA）透射電子顯微鏡（TEM）圖。

????圖2為本發明所得殼聚糖納米顆粒（包裹BSA）動態光散射（DLS）圖。

圖3為本發明所得殼聚糖納米顆粒（0.5mg/mL）體外吸附RNA實驗結果圖。

圖4??僅FAM-siRNA（FAM，發射波長520nm，綠色熒光）進Hela細胞圖。

圖5?為本發明所得殼聚糖納米顆粒（100μg/mL）將FAM-siRNA載帶進Hela細胞圖（488nm激發）。