[發(fā)明專利]植物種子DNA快速提取試劑盒及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310245268.7
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103289991A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金蕪軍;張秀杰;宛煜嵩;賀輝群;董美
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京康思博達知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種DNA提取試劑盒，尤其涉及植物種子DNA的快速提取試劑盒及其應用，屬于植物種子DNA的提取領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

在分子生物學研究中，高質(zhì)量的DNA的提取是其下游生物學應用的關(guān)鍵。隨著分子生物學的發(fā)展，多種植物材料的DNA的提取方法已建立，包括：CTAB法、SDS法、PVP法、尿素法或高鹽低pH法等。不同植物材料中，蛋白質(zhì)、多糖、酚類物質(zhì)的含量差別較大，分離或提純獲得高質(zhì)量的DNA存在一定的難度。針對不同植物材料的細胞壁和細胞內(nèi)容物存在的差異，采用適宜的植物DNA的提取方法，才能保證DNA的提取質(zhì)量。?

植物種子中通常含有大量的多糖、蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)（黃小丹，張云貴，應鐵進.高質(zhì)量植物基因組的提取［J］.植物生理學通訊，2006,42（2）：311-314），有效去除這些物質(zhì)是DNA分離過程中最重要也是最難的環(huán)節(jié)之一。?

目前，對植物種子DNA大多采取液氮研磨后用CTAB法、SDS法或高鹽低pH法等提取基因組DNA。但是這些提取方法大多存在DNA的得率較低、雜質(zhì)較多（含有較多的蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、多糖等雜質(zhì)）的缺陷，有待改進。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種植物種子DNA快速提取試劑盒。?

本發(fā)明的目的之二是將所述的植物種子DNA快速提取試劑盒應用于提取植物種子DNA。?

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：?

一種植物種子DNA快速提取試劑盒，包括：CTAB裂解液，硅基質(zhì)膜DNA吸附柱，RNA酶，過柱緩沖液，漂洗液1，漂洗液2和洗脫緩沖液；其中，所述過柱緩沖液的成分包括：2.5-7.0M鹽酸胍，0.05M?Tris-HCl，0.01M?EDTA；其中pH值為4.0-7.0。?

本發(fā)明通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，采用硅基質(zhì)膜DNA吸附柱對DNA粗提液?進行純化時，雖然能夠有效提高DNA的純度，但是DNA的得率較低，其產(chǎn)量難以滿足后續(xù)的分子生物學實驗需要。?

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，過柱緩沖液中鹽酸胍的濃度以及pH值高低對于DNA的得率乃至純度有非常顯著的影響。為了提高DNA的得率和純度，本發(fā)明對過柱緩沖液中鹽酸胍的濃度以及pH值進行了優(yōu)化，以最大限度的改善DNA的得率和純度。?

本發(fā)明通過大量的優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，過柱緩沖液中鹽酸胍的濃度在4.0-5.0M的范圍內(nèi)，pH值為5.0-6.0時，不僅具有較高的DNA得率，而且DNA純度較高；本發(fā)明非常驚奇的發(fā)現(xiàn)，當鹽酸胍的濃度為4.5M，pH值為5.5時，DNA產(chǎn)物的得率相比于其它條件的得率至少高了17個百分點，且DNA產(chǎn)物的純度也最高；因此，本發(fā)明所述的過柱緩沖液中鹽酸胍的濃度最優(yōu)選為4.5M，pH值最優(yōu)選為5.5。?

本發(fā)明所述“CTAB裂解液”可以是現(xiàn)有技術(shù)中任何一種的CTAB裂解液，包括文獻中報道的各種改進的CTAB裂解液；作為參考，所述的“CTAB裂解液”的成分包括：1.4M?NaCl，2%CTAB，0.1M?Tris-HCl?pH8.0，0.02M?EDTA。?

本發(fā)明所述“漂洗液1”或“漂洗液1”可以是現(xiàn)有技術(shù)中任何一種用于漂洗硅基質(zhì)膜DNA吸附柱的漂洗液；優(yōu)選的，所述“漂洗液1”的成分包括：3M?NaAC?pH5.2，無水乙醇；其中，NaAc和無水乙醇的體積比為3:7；所述“漂洗液2”的成份成分包括：0.1M?Tris-HCl?pH7.0，無水乙醇；其中，Tris-HCl和無水乙醇的體積比為3:7。?

本發(fā)明所述的洗脫緩沖液可以為TE緩沖液或去離子水。?

本發(fā)明的另一目的是將所植物種子DNA快速提取試劑盒應用于快速提取植物材料DNA，包括：?

（1）將植物材料研磨成粉后加入CTAB裂解液和RNA酶進行抽提，得到DNA粗提液；?

（2）將DNA粗提液與過柱緩沖液混合，得到混合液；?

（3）將混合液上硅基質(zhì)膜DNA吸附柱，離心；分別用漂洗液1和漂洗液2漂洗吸附柱；?

（4）用洗脫緩沖液洗脫吸附柱，收集洗脫液，即得。?

其中，所述的植物材料是作物種子；優(yōu)選為棉花、水稻、玉米或大豆的?種子。?

作為參考，本發(fā)明試劑盒的組成可參照表1的成分及用量進行組裝。?

表1試劑盒的組成和用量?

本發(fā)明試劑盒中所用的各種原料或材料都可以從生物試劑公司購買得到。?