[發明專利]一種柑橘黃龍病快速診斷方法

有效

• 申請號: 201310244391.7
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103278367A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 毛潤乾;張宇宏;鄭基煥;潘志萍;全金成;黃明度
• 申請（專利權）人: 廣東省昆蟲研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/42;G01N21/78
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于柑橘病害防治領域，具體涉及一種柑橘黃龍病快速診斷方法。

背景技術：

我國是世界上的柑橘生產大國；柑橘產業是我國農業支柱產業，在農業經濟中占有極其重要的地位，在促進農民增收、增加社會就業和社會主義新農村建設中發揮極其重要的作用。柑橘病蟲害是柑橘產業發展的重大障礙，其中最嚴重的是被稱為柑橘“癌癥”的柑橘黃龍病。隨著柑橘生產的快速發展，柑橘黃龍病的發生和為害越來越嚴重。該病是一種為害極大的傳染性病害，其流行持續時間長、發病范圍廣、發病率高，造成我國大部分地區柑橘壽命短、產量低、生產成本高，每年經濟損失高達數十億美元，嚴重困擾和制約我國乃至世界范圍內柑橘產業的發展。

研究結果已證明，田間的黃龍病病菌主要是由柑橘木虱傳播的。因此，防治柑橘木虱，減少田間柑橘木虱的種群數量，成為控制黃龍病的核心問題。廣東省昆蟲研究所在柑橘木虱和柑橘黃龍病方面進行了比較深入的研究，并申請發明專利“一種柑橘園控制柑橘木虱和黃龍病的方法”，申請號：201310049098.6。

然而，目前黃龍病防治面臨的主要問題是難度大，技術要求高，實施較困難。其問題的關鍵是由于檢測診斷技術跟不上，種植戶不認為自己的柑橘樹染上黃龍病，所以也就不積極去采取措施。因此，快速準備易操作的檢測診斷技術，成為黃龍病防治的急需的技術難點。

目前，檢測診斷技術主要田間癥狀診斷及指示植物鑒別、電鏡檢測診斷、免疫學檢測診斷、核酸分子檢測診斷、基于淀粉碘反應的診斷方法（張利平，2009），其中PCR技術是目前的主流技術（鄧曉玲等，1999；王中康等，2004；孟祥春等，2007）。基于淀粉碘反應的診斷方法來源于Schneider(1968)發現黃龍病感染的葉片中淀粉含量很高，2002年Masatoshi?Onuki用組織學方法證實了感染黃龍病的柑橘葉片積累大量的淀粉粒。Le?Thi?Thu?Hong和Nguyen?Thi?Ngoc?Truc（2003）隨后建立了碘反應診斷黃龍病技術，技術要點為：（1）采集黃龍病特征的葉片，采集時不要采集內膛葉、卷葉、嫩葉，采集時間為早晨，不要采集枝、果和根。（2）取1g的葉片，與2ml蒸餾水混合，研碎。（3）滴加2μL葉和水的混合液在反應膜上(NCM，NitroCellulose?Membrane)，5分鐘后，滴加2μL碘液在反應膜的樣品上。（4）觀察葉片顏色變化，等待結果，陰性反應顏色不變，陽性則變藍。日本TAKUSHI(2007)測定感染黃龍病的柑橘葉片中淀粉含量是400-500mg/kg，正常葉片為85.6mg/kg，并建立快速診斷技術，他們用砂紙擦刮葉片表面20下，然后將砂紙放在塑料袋中，向袋內加25μL的碘液顯色。馬來西亞的Lily?Eng（2007）用不同的砂紙重復了上述方法。我國張利平等（2009）重復該技術，磨碎采集的柑橘感病材料，加等量的純水，然后吸取4μL葉片和水混合液于反應膜上，等5分鐘，滴加等量的碘溶液，觀察顏色變化，試驗結果與PCR結果一致性可以達到93.3%。

本發明人通過研究發現：目前淀粉顯色技術之所以沒有廣泛應用是因為以下原因，（1）由于早晨采樣，沒有真正消除正常葉淀粉的影響。正常葉進行光合作用積累淀粉，有時由于環境因素，晚上可能不能完全轉移，導致早晨正常葉中有淀粉殘留；（2）由于上述技術沒有去掉葉綠素，顯色時存在干擾，也可能影響檢測診斷準確率；（3）上述診斷技術中需要與水混合進行研磨，而淀粉是不溶于水的，與水混合進行顯色反應，準確性易受影響。

發明內容：

本發明的目的是提供一種簡便快速，準確性高的柑橘黃龍病快速診斷方法。

本發明的柑橘黃龍病快速診斷方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、暗處理：用黑色袋子套住待檢測的柑橘的葉片，封口，暗處理12-24小時，得到暗處理后的葉片；或者采集待檢測的柑橘的枝條，帶回室內，插在水中，再用黑色袋子套住葉片或放在暗室中，暗處理12-24小時，收集葉片得到暗處理后的葉片；或者在日出之前，去采集過夜的待檢測的柑橘的葉片作為暗處理后的葉片；