[發明專利]一種胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑及檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201310242951.5
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103344773A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 李迺昶;李會強;周宇捷;任峰
• 申請（專利權）人: 天津美德太平洋科技有限公司
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;C12N15/12;C12N15/85;C07K14/72
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 董一寧

1.一種胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑，其特征在于：其主要組份及含量如下：

每100μl的檢測試劑中：

基因重組GLP-1受體??20μg；

二肽基肽酶-4抑制劑??占血漿樣本重量的1%；

三磷酸腺苷??480μg；

三磷酸鳥苷??10μg；

3-異丁基1-甲基黃嘌呤??0.5mg；

膜反應液??100μl。

2.根據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑，其特征在于：所述的GLP-1受體的制備步驟如下：

⑴真核細胞GLP-1受體表達

①根據人GLP-1受體的序列設計引物，5′端引入BglII酶切位點和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位點和終止密碼；5’端引物序列見序列1，3’端引物序列見序列2；

②用PCR方法擴增DNA片段，模板來自胎兒正常胰島組織的cDNA文庫，反應條件為：

94℃，30s；

60℃，20s；

72℃，90s；

25個循環后，72℃延伸7min；

③反應結束后，凝膠電泳提取PCR片段（1.4Kb），分別用BglII和XhoI消化PCR產物并用QIAGEN?Plasmid?Mini?Kits純化DNA片段；使用NheI和XhoI消化質粒pcDNA3.1(+)(5.4kb)；

④按照DNA的重量比為1:5-10的比例將PCR片段和質粒片段在DNA連接酶的作用下連接起來，將新構建的質粒轉入Ecoli?DH5α細菌中；

⑤通過氨芐青霉素篩選步驟④中轉入Ecoli?DH5α的細菌，挑取單菌落，PCR鑒定后，提取純化重組質粒；

⑥使用電穿孔將重組質料轉染CHO細胞株，用G418篩選細胞株，擴增并提取蛋白質，確定該細胞株表達GLP-1受體，液氮凍存備用；

⑵提取表達GLP-1受體細胞膜的過程

①向洗滌細胞中加入harvesting緩沖液，在溫箱中孵育后，離心，棄去上清液；

②將離心后的沉淀重新懸浮，將其在冰上孵育后破碎細胞，得細胞液；

③將步驟②中細胞液離心；將沉淀重新懸浮，再向其中加入蛋白質，最終調整為2mg/mL，即得GLP-1受體。

3.根據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑，其特征在于：所述的二肽基肽酶-4抑制劑為磷酸西他列汀。

4.根據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑，其特征在于：所述的膜反應液的組成成份及重量份數g/L為：

余量為雙蒸水；

pH=7.4。

5.根據權利要求3所述的胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑，其特征在于：所述的膜反應液的組成成份及重量份數g/L為：

余量為雙蒸水；

pH=7.4。

6.一種胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑盒，其特征在于：包括權利要求1至5任一項所述的檢測試劑。

7.一種如權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1生物學活性檢測試劑的檢測方法，其特征在于：步驟如下：

⑴加入GLP-1受體、膜反應液、待測標本及GLP-1標準品后，于30℃振蕩下，孵育5-10min；同時設定自身對照；利用GLP-1系列標準品繪制標準曲線；

⑵吸取步驟⑴中反應液加入cAMP酶聯免疫吸附試驗試劑盒微孔板中，并向微孔板中加入樣本稀釋液及辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，使待檢測的cAMP與酶標抗體結合；

其中，反應液體、樣本稀釋液和辣根過氧化物酶標記的檢測抗體的體積比為：1：4：10。

⑶洗去未結合的酶標抗體后加入底物TMB顯色，反應完成后，測定反應GLP-1的量；

其中，各物質的添加量均按照權利要求1的配比。