[發明專利]高通量液相色譜法串聯質譜法檢測25羥基維生素D的方法

有效

• 申請號: 201310242935.6
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN103308621A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 趙蓓蓓;程雅婷;董衡;梁曉翠;李卓陽;佘旭輝;文國學;陳靜宜;李維;吳華順;潘文敏
• 申請（專利權）人: 廣州金域醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及維生素D檢測的技術領域，特別涉及一種高通量液相色譜法串聯質譜法檢測25羥基維生素D的方法。

背景技術

維生素D是固醇類衍生物，25羥基維生素D是維生素D經肝臟單氧化酶—25羥基氧化酶氧化后的產物，由于其與維生素D的其它代謝產物相比，在血液中的濃度高且循環周期長，而成為維生素D體內濃度的良好指示劑，是人體維生素D營養狀況的評價指標。

而維生素D家族成員中最重要的成員是維生素D2和維生素D3。維生素D2多含于植物性食物中，它是由植物的麥角固醇經陽光照射而合成的。維生素D3可由人體皮膚自身合成，也可通過食物攝取。維生素D在調劑人體血清鈣、磷水平中具有重要生理學作用。

維生素D2和D3長期被認為是生物學等價的，然而最近的報道表明這兩種形式的維生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差異（Armas?etc，（2004）J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5387-5391）。

傳統的25羥基維生素D檢測方法有放射免疫法、競爭蛋白結合法、高效液相色譜法等，但是主要存在如下問題：第一、由于25羥基維生素D在人體內主要與血清結合蛋白DBP結合，且人體內存在大量的高親和力結合蛋白，因此檢測存在嚴重的基質干擾。而傳統的放射免疫法和競爭蛋白結合法，不能有效祛除基質干擾；第二，現有檢測技術，前處理復雜、分析時間長，方法特異性差；第三，不能同時準確定量25羥基維生素D₂和25羥基維生素D₃的含量，無法給出準確的25羥基維生素D的含量；第四，整個檢測過程時間長、通量低。

因此，需要本領域技術人員迫切解決的一個技術問題就是：如何能夠提供一種適用于人血清的25羥基維生素D的檢測方法，前處理簡單，并能有效祛除基質干擾，可以同時準確定量檢測25羥基維生素D₂和25羥基維生素D₃，并且整個檢測過程時間短、通量高。

發明內容

本發明實施例所要解決的技術問題是提供一種適用于人血清的25羥基維生素D的檢測方法，能夠有效去除基質干擾，快速檢測。

為了解決上述問題，本發明公開了一種高通量液相色譜串聯質譜法檢測25羥基維生素D的方法，包括：

（1）、向人血清樣品加入含有25羥基維生素D內標物的乙腈溶液進行蛋白沉淀；充分混勻后加入正己烷萃取溶劑；充分混勻后離心，接著移取上清液并進行干燥后，加入復溶劑，得到待測樣品；

其中，所述人血清樣品與所述乙腈溶液、正己烷萃取溶液的體積比為1：2：4；所述上清液與對應的原溶液的體積比為1：2；所述復溶液與人血清樣品的體積比為1:2；

（2）、對所述待測樣品用液相色譜串聯四級桿質譜儀進行檢測；

所述檢測采用正離子模式，掃描方式采用多反應監測離子掃描MRM；

其中，目標定量離子對包括25羥基維生素D₂定量離子對，和25羥基維生素D₃定量離子對；目標定量離子的多反應監測離子掃描MRM的條件包括：

25羥基維生素D₂的母離子的質/荷比為412.7～413.7，對應的子離子的質/荷比為394.8～395.8；

25羥基維生素D₃的母離子的質/荷比為400.7～401.7，對應的子離子的質/荷比為382.9～383.9；

其中，所述液相色譜采用梯度模式洗脫，液相色譜條件包括：

色譜柱：2.7um2.1mm×50C18；

色譜柱柱溫：55℃；

進樣量：20ul；

流速：0.9ml/min；

流動相：含0.1%甲酸的甲醇，以及，含0.1%甲酸的水；

25羥基維生素D₃的保留時間為2.60min，和/或，25羥基維生素D₂的保留時間為2.80min；

（3）、依據25羥基維生素D₂和/或25羥基維生素D₃的相對保留時間，以及，25羥基維生素D₂定量離子對和/或25羥基維生素D₃定量離子對的豐度比，判斷25羥基維生素D₂和/或25羥基維生素D₃的存在；