[發明專利]檢測陰道加德納桿菌的引物、探針及方法和試劑盒無效

申請號：	201310242560.3	申請日：	2013-06-19
公開（公告）號：	CN103333961A	公開（公告）日：	2013-10-02
發明（設計）人：	車團結;徐進章;尤崇革;黃超杰;李琳	申請（專利權）人：	蘭州百源基因技術有限公司
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11;G01N21/64
代理公司：	北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249	代理人：	高松
地址：	730000 甘***	國省代碼：	甘肅;62
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摘要：
搜索關鍵詞：	檢測陰道加德納桿菌引物探針方法試劑盒
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于分子生物學體外診斷試劑技術領域，特別是涉及用于檢測陰道加德納桿菌的引物和探針，本發明還涉及利用該引物和探針進行陰道加德納桿菌檢測的方法和試劑盒。?

背景技術

陰道加德納桿菌（Gardnerella?vaginalis，GV）是細菌性陰道病(Bacterial?vaginosis，BV)的主要病原體，可經性接觸傳播。在BV患者和健康婦女中，陰道加德納桿菌檢出率存在顯著差異，在BV的微生物菌群中GV處于優勢地位，數量明顯高于其他非正常菌群。細菌性陰道炎在婦科門診中的患病率為18%-20%，發病率45%，居其他陰道炎之首。因此對于陰道加德納桿菌的檢測對于細菌性陰道炎的早期診斷、早期治療以及預防控制等至關重要。?

????目前對陰道加德納桿菌的實驗室診斷主要有直接涂片革蘭染色找線索細胞、細菌分離培養以及PCR等。直接涂片革蘭染色找線索細胞和加德納桿菌法，是臨床最常見的檢測方法，該方法同時可進行真菌和淋病等檢測，是一種相對簡便易行的常規方法，由于該方法誤判率高、不能作為一種確診方法，只能作為一種常規篩查。細菌分離培養法是檢測GV的金標準，準確可靠，但其培養要求高，陽性檢出率低，易受藥物等環境因素的影響，且耗時長、花費大。普通PCR技術可以避免這一問題，但是存在靈敏度低、易污染造成假陽性等缺點，同時常規PCR專利已經失去保護，很難形成商品化試劑盒。?

?實時熒光定量PCR（Fluorescence?quantitative?PCR）技術從常規PCR定性檢測邁上量化的臺階，它相對常規PCR技術先進、操作簡便、利用實時熒光定量PCR技術能夠實現實時監測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點，因此非常適合臨床檢測。目前國內尚無檢測陰道加德納桿菌的實時熒光PCR技術以及試劑盒的相關專利。?

發明內容

本發明的目的在于提供用于實時熒光PCR檢測陰道加德納桿菌的特異性引物和探針。?

本發明的另一個目的在于提供檢測陰道加德納桿菌的熒光定量PCR方法及其試劑盒。?

為了實現上述目的，本發明篩選出陰道加德納桿菌的特異性序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示。?

本發明提供用于檢測陰道加德納桿菌上述特異序列的引物，以及與所述引物配合使用的熒光探針。其中，探針5’標記熒光基團為FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’標記淬滅基團為TAMRA、DABCYL或BHQ。該特異引物擴增產物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示。?

在本發明的一個實施方式中，優選的引物序列為：?

上游引物：CTTTTCTCGGCAAGCAGGAT，

下游引物：TTCCGTGGCTAAGCGTGT；

探針序列為：FAM-CCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGC-TAMRA。

????本發明還保護上述引物和探針序列的互補核苷酸序列，或向5’端和3’方向延伸一至數個堿基或刪減一至數個堿基得到的序列。?

????本發明提供一種陰道加德納桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，是以樣品總DNA?為模板，利用本發明提供的引物和探針進行實時熒光定量PCR，同時設立標準品，根據擴增曲線判定結果。?

本發明的實時熒光定量PCR的反應體系，當為20μl反應體系時，其優選配置為：?