[發明專利]一種人輪狀病毒△VP8*亞單位重組蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201310241785.7
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN103319604A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 聞曉波;孔凡志;冉旭華;張峣;曹殿軍;朱戰波;張春山
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/70;A61K39/15;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及動物分子生物學和基因工程領域，具體地說，涉及一種人輪狀病毒△VP8*亞單位重組蛋白及其應用。

背景技術

輪狀病毒性胃腸炎也稱輪狀病毒性腹瀉，是全世界范圍內嬰幼兒及多種幼齡動物腹瀉的最主要的急性腸道傳染病，以腹瀉和脫水為特征，死亡率高，給人類健康和畜牧業發展造成巨大危害。全世界每年大約有1.1億5歲以下兒童患輪狀病毒性胃腸炎，其中有2500萬兒童需就診，200萬兒童必須住院治療，每年約有453000兒童死于輪狀病毒性腹瀉，其中發展中國家和欠發達國家的死亡病例占總數的85%以上。以中國為例，每年約有3萬名兒童死于該病，位列死亡病例總數國家前五位；每年用于治療患兒的醫療費用就達數十億元。感染輪狀病毒（Rotavirus,RV）后，因脫水和電解質紊亂導致重癥腹瀉和死亡，目前尚無特效藥物，臨床治療也只是對癥治療，即補液補鹽。因此開發高效疫苗和治療策略是科研工作的首要任務之一，以此降低發病率和死亡率，減輕該病所造成的社會和經濟負擔。

然而當前兩個人輪狀病毒疫苗：(Merk)和(GSK)，在輪狀病毒威脅最嚴重的地方，疫苗免疫效力卻差強人意。例如：在馬拉維的效力只有48%，在東南亞的效力也只有50%左右。同時也有口服疫苗后發生嚴重腹瀉和疫苗株之間分子重組的報道；此外和與腸套疊的關聯性并沒有排除。例如在澳大利亞的免疫后監測表明和疫苗提高了腸套疊的發病率。因此開發新一代替代疫苗成為了當前廣大科研工作者的頭要緊急任務。

輪狀病毒（Rotavirus，RV）為呼腸弧病毒屬（Reoviridae）成員，病毒基因組由11節段dsRNA組成，編碼6個結構蛋白（VP1～4，VP6～7）和6個非結構蛋白（NSP1～6）。成熟的病毒粒子為三層衣殼結構，最外層由纖突蛋白VP4（蛋白酶裂解形成VP8*和VP5*）和糖蛋白VP7組成。VP7與病毒在富含蛋白酶的成熟的小腸上皮細胞中復制直接相關。VP4蛋白不僅涉及RV的粘附、侵入，而且與RV血凝性、中和活性、毒力以及蛋白酶裂解后感染性增強等理化特性相關。VP7和VP4都可獨立的誘導病毒中和抗體，抗VP7和VP4的抗體都可阻止病毒的侵入。故VP7和VP4都成為疫苗開發的首選目標分子。

輪狀病毒基因型別組合眾多，不同基因型間的交叉免疫甚少，這給疫苗研制帶來了困難。但是，研究發現一個P基因型可能覆蓋數個G基因型，即某個P型可以與不同的G型組合，理論上同一P型可以誘導抗不同G型的異型免疫。而決定P型的VP4蛋白含有多個線性化抗原表位，且該蛋白無需翻譯后修飾，其經胰酶裂解后形成的VP8*片段，包含了VP4型特異性主要抗原表位，皆為線性且較為保守，這提示了我們可以利用VP8*蛋白來開發新型PRV亞單位疫苗。根據Kapikian?AZ等繪制的VP8*表位圖譜，選擇包含了VP8*中和抗原表位的區域，構建截短的VP8*基因（以下用△VP8*表示，含有64-223位的氨基酸）原核表達載體，以獲得可溶性的重組蛋白作為免疫原（Construction?and?characterization?of?human?rotavirus?recombinant?VP8*subunit?parenteral?vaccine?candidates.Wen?X,Cao?D,Jones?RW,Li?J,Szu?S,Hoshino?Y.Vaccine.2012Sep21;30(43):6121-6）。但是，單獨△VP8*蛋白的免疫原性較低，需要對△VP8*蛋白的免疫原性做進一步改善。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明第一目的是提供一種人輪狀病毒△VP8*亞單位重組蛋白。

該重組蛋白包括破傷風毒素T細胞表位P2和輪狀病毒△VP8*亞單位。在本發明的一個實施方案中，所述人輪狀病毒△VP8*亞單位重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2；本領域技術人員可根據該片段，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，人輪狀病毒△VP8*亞單位重組蛋白還包括SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有同等活性的由SEQ?ID?No.2衍生得到的蛋白質。

本發明的第二目的是提供編碼上述人輪狀病毒△VP8*亞單位重組蛋白的基因。在本發明實施方案中，編碼該融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。

本發明的第三目的是提供含有上述基因的表達載體。