[發明專利]含豬圓環病毒2型細胞的培養方法

在審

• 申請號: 201310241711.3
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN104232563A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 何錫忠;李春華;趙本進;張春玲;倪建平;蔣鳳英;彭麗英;張婉華
• 申請（專利權）人: 上海佳牧生物制品有限公司;上海科立特農科（集團）有限公司;上海市農業科學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 林君如

1.含豬圓環病毒2型細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)單個含豬圓環病毒2型PK15細胞克隆及其亞群的培養

將PCV2/SN07-12種毒接種于無1型豬圓環病毒污染的豬腎細胞(PK15細胞)中并在37℃培養箱中培養，使用胰酶消化處于對數生長期的單層含豬圓環病毒2型的PK15細胞，然后采用有限稀釋法，按照每孔100uL含20wt％牛血清細胞生長液，0.5個細胞/孔的密度，加入96孔細胞培養板置于含5vt％CO₂，溫度為37℃培養箱中培養，挑選有單個細胞生長的細胞孔中細胞進行亞克隆培養，使用胰酶消化后，加入牛血清細胞生長液，再加入96孔細胞培養板置于含5vt％CO₂，溫度為37℃培養箱中培養72h；

(2)陽性含豬圓環病毒2型PK15細胞克隆株的篩選

取長滿單層96孔細胞培養板，棄去培養液，PBS洗滌細胞3次，經無水乙醇在-20℃固定2h，封閉液洗滌1次，再利用封閉液在37℃作用30min，加入PCV2抗血清，37℃作用45min，PBS洗滌細胞3次后，加入熒光標記A蛋白(FITC-SPA)，37℃作用45min，洗滌3次后加封片液(Mounting-Fluid)，熒光顯微鏡下挑選熒光數量最多的克隆株為豬圓環病毒2型高感染性的PK15細胞亞群，重復克隆一次，對含豬圓環病毒2型PK15細胞株進行純化后獲得含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞系；

(3)高滴度豬圓環病毒2型的增殖

利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞系并接種于細胞培養瓶內，加入含7wt％-10wt％犢牛血清的DMEM營養液，在37℃培養24h，棄生長液，加入含2wt％犢牛血清的DMEM維持液，于37℃培養72-96h，收獲細胞培養物，凍融3次，既得到高滴度豬圓環病毒2型。

2.根據權利要求1所述的含豬圓環病毒2型細胞的培養方法，其特征在于，步驟(1)中所述的PCV2/SN07-12種毒為圓環病毒屬豬圓環病毒2型(Porcine?Circovirus?Type2)的微生物保藏登記號為：CCTCC?NO：V201304。

3.根據權利要求1所述的含豬圓環病毒2型細胞的培養方法，其特征在于，步驟(2)中獲得含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞系于-196℃保存。