[發(fā)明專利]一種抑制人口腔癌細胞PRPS2表達的shRNA及其載體的構建和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310240702.2
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN103333893A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設計）人: 陳顯久;吳彬;師磊;李冰;解軍
• 申請（專利權）人: 山西醫(yī)科大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00;A61P1/02
• 代理公司: 太原晉科知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 王瑞玲

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學和生物醫(yī)藥技術領域，具體為一種抑制人口腔癌細胞PRPS2表達的shRNA及其載體的構建和應用。

背景技術

5-氟尿嘧啶作為抗代謝藥物的一種，已廣泛應用于多種惡性腫瘤的治療，其作用機制是通過干擾DNA合成與mRNA翻譯導致細胞死亡。然而5-氟尿嘧啶由于其非特異性，對患者產(chǎn)生較強的毒副作用，可能導致冠狀動脈痙攣、冠狀動脈血栓形成、心肌炎和心臟猝死等副作用的發(fā)生[Sorrentino?MF,?Kim?J,?Foderaro?AE,?Truesdell?AG.?5-fluorouracil?induced?cardiotoxicity:?review?of?the?literature[J].?Cardiol?J.?2012;19(5):453-458.]。所以，探尋新的有效抗代謝類藥物是腫瘤治療的一個亟待解決問題。hTERT只在端粒酶陽性細胞和組織中表達，如腫瘤或者干細胞；85%以上的人類惡性腫瘤中端粒酶都會異常表達，但正常細胞中卻無此現(xiàn)象[Hiyama?E,?Hiyama?K.?Telomerase?as?tumor?maker[J].?Cancer?Lett.?2003,?194(2):221-233.]。人正常組織細胞內(nèi)hTERT?基因為單拷貝基因，總長約為40kb，定位于染色體的5p15.33區(qū)，在?hTERT?基因的轉錄起始點上游的181bp?片段為核心啟動子序列，hTERT基因啟動子具有高腫瘤靶向性及較強的啟動活性，從而成為腫瘤靶向基因治療中具有巨大應用潛力的啟動子[王峰，刁勇，許瑞安.?人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子在腫瘤基因治療中的應用[J].?中國生化藥物雜志，2012，33（5）：686-689.]。

PRPS2是PRPS家族成員之一，由PRPS2基因編碼。PRPS2基因是位于X染色體短臂Xp22.2-p22.3的管家基因，幾乎在所有細胞中均有表達，在增殖較快的組織如胸腺、肺、胃、小腸、脾和睪丸組織中表達量較高。腫瘤組織是細胞增殖旺盛的組織，其核苷酸的從頭合成是腫瘤細胞增殖的首要步驟。阻斷腫瘤細胞核苷酸的從頭合成也是目前臨床廣泛應用的抗代謝類腫瘤化療藥物（如5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和環(huán)胞苷等）的作用機制。利用RNA干擾（RNA?interference，RNAi）表達載體，對PRPS2基因的表達進行特異性抑制，有望阻斷腫瘤細胞的惡性增殖和生長，進而達到治療腫瘤的目的。

RNAi是由雙鏈RNA?分子介導的序列特異性轉錄后基因沉默現(xiàn)象，已成為人類基因功能研究的有力工具，同時在基因干預治療的應用中具有很大潛力。特別是應用RNAi?技術在哺乳動物細胞中高效特異阻斷特定基因的表達，為惡性腫瘤的基因治療提供了新方法。RNAi?常用兩種方法:?siRNA?和shRNA。siRNA合成的成本較高，作用時間相對短暫，而且長雙鏈RNA在哺乳動物細胞中會誘發(fā)細胞毒效應。而shRNA?方法對靶基因的作用持續(xù)時間、細胞的毒性反應以及合成價格等方面有一定的優(yōu)勢，因此使用shRNA?進行RNA?干擾是目前較為常用的方法[Brummelkamp?TR,?Bernards?R,?Agami?R．A?system?for?stable?expression?of?short?interfering?RNAs?in?mammalian?cells.?Science，2002，296(5567)：550-553]。

shRNA是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，利用載體把編碼目標shRNA的DNA序列導入細胞，載體中的啟動子可啟動該序列表達為特定shRNA。這種重組了編碼shRNA載體的DNA序列可隨著細胞的增殖而被傳遞到子代細胞中去，從而使目標基因的沉默可被遺傳。導致目標基因表達降低（沉默）的機制是：shRNA在細胞胞液中可形成發(fā)卡結構，然后被細胞液中特定的酶切割成siRNA；siRNA結合到RNA?誘導沉默復合物?(RNA-induced?silencingcomplex，RISC)?上；RISC結合到目標基因轉錄形成的mRNAs上，在其他酶的作用下將其降解，達到目標基因沉默效應[?Paddish?PJ,?Caudy?AA,?Bernstein?E,?et?al．Short?hairpin?RNAs(shRNAs)?induce?sequence-specific?silencing?in?mammalian?cells.?Gen?Dev，2002，16：948-958.]。