[發明專利]一種測定外生菌根真菌C、N、P相關胞外酶活性的方法

無效

• 申請號: 201310239704.X
• 申請日: 2013-06-18
• 公開（公告）號: CN103276050A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 王文杰;李艷紅;王瓊;祖元剛;王慧梅;仲召亮;裴忠雪;任潔
• 申請（專利權）人: 東北林業大學;王文杰
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C12Q1/26;C12Q1/34;C12Q1/04
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1.一種測定外生菌根真菌C、N、P相關胞外酶活性的方法，具體特征在于：1）外生菌根真菌的液體培養；2）真菌胞外粗酶液的制備；3）C相關胞外酶活性的測定方法；4）N相關胞外酶活性的測定方法；5）P相關胞外酶活性的測定方法。

2.根據權利要求1所述的一種測定外生菌根真菌C、N、P相關胞外酶活性的方法，其特征是：外生菌根真菌的液體培養：首先將真菌接種到MMN固體培養基上培養，反復繼代，直至無雜菌產生，然后用MMN液體培養基（去掉瓊脂）培養，0.3g·L^-1的酵母浸粉代替麥芽浸粉和葡萄糖，再加入2種試劑來誘導酶的產生：1)2.5g·L^-1膠質幾丁質來誘導幾丁質酶的產生；2)5g·L^-1的羧甲基纖維素鈉誘導纖維素酶的產生，最后充分混勻分裝培養基于錐形瓶中，高壓滅菌20min(121℃，0.1Mpa)，冷卻后無菌條件下接入菌株，標記后置搖床上（110r·min^-1、25℃）培養15～20d。

3.根據權利要求1所述的一種測定外生菌根真菌C、N、P相關胞外酶活性的方法，其特征是：真菌胞外粗酶液的制備：液體培養基培養15～20d后，將錐形瓶內的菌絲用4層紗布過濾，濾液置于離心管內，10000rpm·min^-1，4℃離心10min，上清液即為粗酶液，取一部分粗酶液煮沸10min，使酶失活作為對照組，然后進行C相關胞外酶（羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、漆酶、多酚氧化酶、愈創木酚氧化酶和幾丁質酶）活性的測定、N相關胞外酶（蛋白酶）活性的測定，另外在無菌條件下取0.5g菌絲體至離心管中，分別添加2ml0.01mol·L^-1醋酸鹽溶液(pH4.8)；2mL0.01mol·L^-1EDTA；2mL0.01%Triton?X；2mL2.5%pvp混勻，4℃離心10min，上清液即為粗酶液，再取一部分粗酶液煮沸10min，使酶失活作為對照組，然后進行P相關胞外酶（酸性磷酸酶）活性的測定。

4.根據權利要求1所述的一種測定外生菌根真菌C、N、P相關胞外酶活性的方法，其特征是：C相關胞外酶活性的測定方法：1)羧甲基纖維素酶活性的測定：在試管中加入1%的羧甲基纖維素鈉溶液（用pH4.60.1mol·L^-1醋酸緩沖液配置）0.9mL，加0.1mL的酶液，50℃條件下反應30min，取出后立即加入DNS試劑0.75mL，煮沸5min，待冷卻后加8.25mL蒸餾水，充分混勻于520nm處測OD值，做3個平行測定取平均值，然后另取同量酶液，沸水浴煮沸10min滅活作為對照測定試驗，以50℃條件下1h由底物產生1μmol的葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位；2)β-葡萄糖苷酶活性的測定：取50μL?40mmol·L^-1的p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside作為底物加入到0.9mL0.01mol·L^-1醋酸鹽緩沖溶液(pH5.5)中，再加50μL的酶液，45℃條件下反應30min，然后加3mL1mol·L^-1Na₂CO₃終止反應，于400nm處測OD值，做3個平行測定取平均值，另外取同量酶液，沸水浴煮沸10min滅活作為對照測定試驗，以45℃條件下1h由底物產生1μmol對硝基苯所需要的酶量為1個酶活力單位；3)多酚氧化酶活性的測定：取0.1mol·L^-1的鄰苯二酚0.25mL作為底物，加入2.0mL0.1mol·L^-1醋酸緩沖液(pH5.5)和0.75mL酶液，30℃條件下反應30min，立即于420nm處測OD值，做3個平行測定取平均值，然后另取同量酶液，沸水浴煮沸10min滅活作為對照測定試驗，以1h內OD420值變化0.01為1個酶活力單位；4)漆酶活性的測定：取1mmol·L^-1的ABTS0.5ml作為底物，加2.0mL0.1mol·L^-1醋酸緩沖液(pH4.6)和0.2mL酶液，28℃下反應30min，立即于600nm處測OD值，做3個平行測定取平均值，然后另取等量酶液，沸水浴煮沸10min滅活作為對照組，以1h內OD600值變化0.01為1個酶活力單位；5)愈創木酚氧化酶活性的測定：取0.5mL80mmol·L^-1的愈創木酚(用pH4.60.1mol·L^-1醋酸緩沖液配置)作為底物，加3.0mL?0.1mol·L^-1醋酸緩沖液(pH4.6)和0.5mL酶液，置28℃條件下反應30min，立即于490nm處測OD值，做3個平行測定取平均值，然后另取等量酶液，沸水浴煮沸10min滅活作為對照組，以1h內OD420值變化0.01為1個酶活力單位；6)幾丁質酶活性的測定：取1mL?1%的膠質幾丁質加入到0.1mol·L^-1pH5.5的醋酸緩沖溶液中，加0.6mL的酶液，37℃條件下反應3h，再加0.75mL?DNS試劑終止反應，煮沸10min，加1mL?18.2%的酒石酸鈉，10000rpm·min^-1，4℃離心10min，于530nm處測OD值，做3個平行測定取平均值，然后另取同量酶液，沸水浴煮沸10min滅活作為對照測定試驗，以37℃條件下1h由底物產生1μmolN-乙酰基-D-葡糖胺所需要的酶量為1個酶活力單位。