[發明專利]一種羊胚胎細胞培養液

有效

• 申請號: 201310239561.2
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103333855A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 鄒賢剛;趙雅琳;袁三平
• 申請（專利權）人: 青島森淼實業有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于細胞體外培養技術領域，具體涉及一種羊胚胎細胞培養液。

技術背景

自20世紀80年代以來，轉基因動物研究在改良生長發育速度、營養成分、對環境條件的抗性及環境污染指示物等領域取得重大進展，尤其是轉基因動物乳腺生物反應器技術在生產藥用蛋白及功能食品等領域的應用，彰顯了轉基因動物研究技術的強大應用潛力。

而胚胎體外培養是轉基因動物研究領域的一個重要環節。體外培養胚胎的環境直接影響胚胎的發育及移植后的出生率等。大量長期的研究表明，體外培養環境的主要因素之一是胚胎體外正常發育的培養基。目前體外培養通常以M16為基礎培養基，然后添加氨基酸、細胞生長因子、EDTA等添加劑。但是早期胚胎在體外培養過程中對環境變化相當敏感，與體內胚胎相比，存在質量差、移植受胎率低等問題，束縛著轉基因動物研究技術的發展。

發明內容

本發明的目的是提供一種羊胚胎細胞培養液，以彌補現有培養技術的不足。

本發明的培養液，為包含有如下組分的水溶液：0.25g/L的二水氯化鈣，0.16g/L的無水硫酸鎂，0.35g/L的氯化鉀，0.16g/L的磷酸二氫鉀，2.10g/L的碳酸氫鈉，5.53g/L的氯化鈉，4.00g/L的牛血清白蛋白，1.00g/L的葡萄糖，0.036g/L的丙酮酸鈉，2.95g/L的乳酸鈉和0.01g/L的酚紅鈉。

另外，根據胚胎培養的不同階段，選擇性的添加如下濃度的組分：5μmol/L的離子霉素、2mmol/L的6-二甲基苯胺嘌呤、5μg/ml的細胞松弛素。

為了使本發明的培養液具有更好的細胞培養效果，在上述的培養液中還添加有體積比濃度為10%的胎液。

上述胎液為懷孕中期的母羊的子宮胎液。

本發明的培養液用于對羊的胚胎或重組胚胎細胞的體外培養。

本發明的培養液通過組分之間的協同作用，減少了對早期胚胎的刺激作用，更利于胚胎的發育。而且，在培養液中還添加了10%的母羊的子宮胎液，能顯著提高重構胚的融合率。與不加胎液的培養液相比，添加胎液的培養液能顯著提高體外培養胚胎的存活率、囊胚率。同時，本發明的培養液能增加子宮容受性，顯著提高了產羔率。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的培養基進行詳細的描述。

1、?胎液的制備：

胎液按照目前已有的方法來制備，首先為孕羊做B超，確定胎盤位置，避免誤傷胎盤。選好進針點，消毒皮膚，用腰穿針在選好的點垂直刺入。針穿過腹壁和子宮壁，抽取胎液，然后分別裝在消毒試管內，加蓋，備用。

2、?基礎培養液及添加劑

本發明基礎培養液配制所需的各相關成分詳見表1。分別取各相關成分所需的量，加入到1000ml重蒸餾水中充分混合均勻。

配制5μmol/L的?Ionomycin、2mmol/L的6-DAMP、5μg/ml的CB。

3、將上述溶液分別混合

混合液（1）：基礎培養液+10%胎液+5μmol/L的?Ionomycin；混合液（2）基礎培養液+10%胎液+2mmol/L的6-DAMP+5μg/ml的CB；混合液（3）基礎培養液+10%胎液。

不同的混合液在胚胎培養的不同階段使用。

表1：本發明的基礎培養液各成分含量

利用本發明方法進行胚胎的體外培養，并比較了該培養液對胚胎的囊胚率及產羔率的影響。實驗設置了3個組，分別為：按本發明配制的胚胎培養液（處理1）；按本發明組分配制，但是未添加胎液的胚胎培養液（處理2）；用商品化的M199作為胚胎培養液（處理3）。每個處理重復4次。

1.?不同培養液對胚胎發育的影響，實驗如下：

融合后的胚胎培養在混合液（1）的培養液里，培養5分鐘。然后洗滌數次，再置于混合液（2）的培養液里培養4小時。然后轉移至混合液（3）的微滴液中培養5小時。按上述方法，將混合液（1）、（2）、（3）作對應處理，實驗結果用融合率及卵裂率來評定。

2.?采用體內暫培養的方式，比較不同處理方法的培養液對轉基因動物出生率的影響

將實驗1的重構胚，用1%去瓊脂糖包埋二次后，移植至同步發情的寄母羊的經結扎的輸卵管中暫培養，5-6天后回收，統計其發育率。將發育至囊胚期的胚胎再移植至同步情期的子宮中待其出生。試驗結果用囊胚率、出生率來評定。

3.?采用直接移植的方式，比較不同處理方法的培養液對轉基因動物出生率的影響