[發明專利]一種利用DNA熔解溫度分析水稻Pita基因的功能標記

有效

• 申請號: 201310238711.8
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103333887A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 郭濤;羅文龍;陳志強;王慧;黃翠紅;肖武名;劉永柱;張建國
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用DNA熔解溫度分析水稻Pita基因的功能標記開發。

背景技術

水稻是我國重要的農作物，其產量的穩定性直接關系到國計民生。稻瘟病是水稻的毀滅性病害，對水稻的產量造成重大影響，高抗稻瘟病一直是水稻新品種培育的關鍵目標。提高稻瘟病抗性最有效的方法是培育攜帶抗病基因的品種，這就需要對抗病基因的準確高效鑒定。傳統的稻瘟病抗性檢測，是通過人工剪葉然后接種稻瘟病菌的方式鑒定，該方法檢測結果穩定性較差、周期較長、技術條件要求高，無法滿足在育種低世代大群體的鑒定要求。最有效的抗性鑒定方法，應是直接對稻瘟病抗性基因進行選擇。

????研究表明，Pita基因與水稻稻瘟病抗性相關。Pita基因位于水稻第12染色體靠近著絲點附近的區域，定位于BAC克隆BAC142E8上。Pita基因包含2個外顯子和1個1463bp?的內含子，編碼一個長度為928?個氨基酸的細胞質膜受體蛋白，該蛋白含NBS結構域和富亮氨酸結構域(LRD)，Pita位點上的抗感兩基因的編碼產物僅有一個氨基酸的差異，即第918氨基酸由抗病產物的丙氨酸變異為感病產物的絲氨酸，其抗病機制是Pita基因的編碼產物能與稻瘟病菌的無毒基因AVR-Pita表達產物相互作用引發抗病反應。根據Pita基因第918氨基酸的G/T變異，王忠華等設計了半顯性標記YL155/YL87、YL183/YL87區分抗病基因Pita和感病基因pita，抗病基因利用YL155/YL87可擴增出1.2kb的片段，而YL183/YL87無法擴增出片段。但是，由于這一功能標記需兩次聚丙烯酰胺凝膠電泳后方能判別基因型，成本較高、操作較繁雜，使其難以得到普遍應用。

????成本低、簡便實用、重復性好的共顯性標記，是有效開展分子輔助選擇育種的重要基礎。DNA序列的差異會導致DNA熔解溫度的不同，如Pita和pita兩種等位基因在第918氨基酸的G/T變異，將導致該DNA區段Pita比pita的熔解溫度高1℃。如果能利用DNA熔解溫度檢測基因型，將可避免凝膠電泳的缺陷，實現批量化、自動化、全封閉的基因型檢測。利用DNA熔解溫度判別基因型在人類疾病的研究中已有報道，但是，該技術涉及環節較多、需詳盡的前期優化工作，目前在水稻上系統開展此技術研究的報道較少，這在一定程度上限制了其在水稻育種中的廣泛應用。

發明內容

為了解決背景技術的技術問題，本發明提供一種稻瘟病抗性基因功能標記Pita-G/T，所述的Pita-G/T由兩對引物Pita-G/T-out、Pita-G/T-in構成，引物序列如下：

????Pita-G/T-out：正向引物序列（5’-3’）為SEQ?ID?NO:1?CCCAGGTTACAACTTACAAGGA；反向引物序列（5’-3’）為SEQ?ID?NO:2?CTCTG?AAGAC?GTGAA?GAGGA?TT，

Pita-G/T-in：正向引物序列（5’-3’）為SEQ?ID?NO:3?CTTCT?TTCTT?TCTCT?GCCGT?GG；反向引物序列（5’-3’）為SEQ?ID?NO:4?TCATC?AAGTC?AGGTT?GAAGA?TGC。

????根據需求提供該區別稻瘟病抗性基因功能標記Pita-G/T的應用，所述的應用為區分稻瘟病抗性基因與稻瘟病感病基因。

????并根據實際的需要，提供一種區分稻瘟病抗性基因Pita與稻瘟病感病基因pita的方法，包括以下步驟：

S1.?以待測基因組DNA為模版，利用根據權利要求1所述的Pita-G/T-out擴增；

S2.?將步驟S1擴增所得的基因組稀釋，并以之為模版，利用根據權利要求1所述的Pita-G/T-in擴增；

S3.?利用儀器檢測步驟S2擴增所獲的DNA的熔解溫度，如果待測DNA的熔解溫度在78.8~79.3℃之間，待測水稻為抗稻瘟病水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.8~78.3℃之間，待測水稻為感稻瘟病水稻。

本發明通過研究發現稻瘟病抗性基因Pita的熔解溫度為79.1，稻瘟病感病基因pita的熔解溫度為78.1，稻瘟病抗性基因Pita的熔解溫度比等位基因pita的熔解溫度高了1℃，所以，通過熔解溫度就可以區分Pita和pita序列差異，從而判別水稻材料的基因型（抗病或感病）。如果待測水稻的DNA的熔解溫度在78.8~79.3℃之間，可判斷待測水稻為抗稻瘟病水稻；如果待測DNA的熔解溫度在77.8~78.3℃之間，可判斷待測水稻為感稻瘟病水稻。