[發(fā)明專利]產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法、試劑盒及應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310237095.4 | 申請日： | 2013-06-17 |
| 公開（公告）號： | CN103343164A | 公開（公告）日： | 2013-10-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李睿;王宏勛;畢旺來;劉文斌;伍金娥;余曉麗 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢輕工大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12N15/11;C12Q1/10;C12R1/19 |
| 代理公司： | 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104 | 代理人： | 杜傳青 |
| 地址： | 430023 湖北省武*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 產(chǎn)志賀 毒素 大腸桿菌 多重 pcr 檢測 方法 試劑盒 應(yīng)用 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法、試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)
產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌是一種重要的食源性致病菌，主要代表為大腸桿菌O157:H7。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌能產(chǎn)生志賀毒素，可以牛肉、雞肉、水果和蔬菜等為載體傳播，引起人得出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥等嚴(yán)重食物中毒并發(fā)癥，嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)生急性腎衰竭而死亡。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌主要毒力因子是位于噬菌體上的stx1、stx2基因，這兩種基因分別編碼志賀毒素Stx1、Stx2。
我國自1986年首次報告大腸桿菌O157:H7?感染的病例以來，曾于2001年在江蘇、安徽等地兩度暴發(fā)大腸桿菌O157:H7導(dǎo)致的感染性腹瀉。共造成177人死亡，中毒人數(shù)超過2萬人。這是迄今為止人類歷史上最為嚴(yán)重的O157:H7感染疫情。近年來，世界各國產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的感染流行均呈上升趨勢。非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌引起的食物中毒并發(fā)癥嚴(yán)重程度也在不斷增加。2011年德國致病性大腸桿菌暴發(fā)的元兇亦為一種少見的血清型O104:H4。
隨著對大腸桿菌O157:H7研究的深入，很多國家和地區(qū)相繼報道發(fā)現(xiàn)了不產(chǎn)志賀毒素，即不具有致病性的O157:H7菌株。而現(xiàn)有的大腸桿菌O157檢測方法只檢測O157標(biāo)志基因，如rfbO157基因（食品中多種致病菌快速檢測方法?PCR法，SN/T?1869-2007），不能進一步判定大腸桿菌O157是否具有毒力。另外，由于stx1和stx2基因的不同亞型核苷酸序列差異較大，stx1基因的變種根據(jù)基因序列的差異，分為stx1、stx1c、stx1d，而stx2基因的變種可分為stx2、stx2c、stx2d、stx2e和stx2f，很難用一種通用引物同時擴增出所有基因亞型或主要基因亞型。再者，一個反應(yīng)中使用的引物數(shù)目越多，引物之間越容易相互干擾，形成引物發(fā)夾環(huán)或引物二聚體，導(dǎo)致PCR擴增困難，檢測靈敏度大大降低。因此，針對產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的PCR檢測來說，設(shè)計一種能在一個PCR反應(yīng)中完成志賀毒素編碼基因和O157特征基因的檢測，并能鑒別O157血清型大腸桿菌致病菌和檢測出stx1和stx2基因及其常見亞型、具有特異性、廣譜性的多重PCR引物比較困難。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、快速、簡便、特異性強、廣譜性好的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌多重PCR檢測試劑盒。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法及試劑盒在食品檢測中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法，該方法通過三重PCR反應(yīng)，經(jīng)電泳染色、紫外觀察，能同時檢出stx1、stx2、wzyO157基因，且stx1基因的檢測引物能擴增出stx1和?stx1c亞型，stx2基因的檢測引物能擴增出stx2、?stx2c和?stx2d亞型，wzyO157基因的檢測引物能鑒別O157血清型菌株；
所述stx1基因的檢測引物為：
上游引物stx1F序列為SEQ.ID.No.1，
下游引物stx1R序列為SEQ.ID.No.2，
所述stx1基因的擴增序列為SEQ.ID.No.3；
所述stx2基因的檢測引物為：
上游引物stx2F序列為SEQ.ID.No.4，
下游引物stx2R序列為SEQ.ID.No.5，
所述stx2基因的擴增序列為SEQ.ID.No.6；
所述wzyO157基因的檢測引物為：
上游引物wzyF序列為SEQ.ID.No.7，
下游引物wzyR序列為SEQ.ID.No.8，
所述wzyO157基因的擴增序列為SEQ.ID.No.9。
為實現(xiàn)本發(fā)明的第二個目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
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