[發明專利]刺糖多胞菌HBERC?25376及其培養、活性物質分離方法與應用

有效

• 申請號: 201310236997.6
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN103361276B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發明（設計）人: 萬中義;楊自文;王開梅;江愛兵;方偉;張亞妮;張志剛;閔勇;曹春霞;劉曉艷;龍同;吳兆園;廖先清;劉芳;黃大野;朱志剛
• 申請（專利權）人: 湖北省生物農藥工程研究中心
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P17/06;C12P17/18;C07D493/08;C07D493/10;C07D491/18;A01N43/90;A01P7/04;A01P1/00;A01P3/00;A61K31/366;A61K31/4025;A61K31/407
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司42104
• 代理人: 朱盛華

技術領域

本發明涉及一種刺糖多胞菌HBERC-25376及其培養方法，活性物質的分離方法，及在農作物病蟲害防治中的應用。

背景技術

近年來，我國農藥殘留導致的食品安全問題非常突出，頻頻發生的農藥中毒事件不斷給全社會敲響了警鐘。同時因大量高毒高殘留化學農藥的使用，導致我國農產品出口形勢嚴峻，而且對土壤、水體、大氣造成嚴重污染，破壞生態平衡。生物農藥是綠色食品和有機農產品生產不可或缺的生產資料，對于保證農產品質量安全和生態環境安全，提高人民生活水平具有重要的積極意義。

發明內容

本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種懸浮率高，噴藥不堵塞噴頭，可噴霧，也可顆粒劑穴施，防治效果好的刺糖多胞菌HBERC-25376及其培養方法，活性物質的分離方法與在農作物病蟲害防治中的應用。

本發明目的的實現方式為，刺糖多胞菌HBERC-25376，菌種代號為HBERC-25376，Saccharopolyspora spinosa HBERC-25376，保存在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No：M2013076。

形態特征如下：菌落直徑2-3mm，分散狀；基絲無色，直徑約0.6-0.8μm；氣絲白色至灰白色，直徑0.8-1.0μm，菌苔表面粉狀；孢子絲直至彎曲形，每鏈含20-30個卵圓形孢子，孢子大小1.0×1.5μm。

刺糖多胞菌HBERC-25376培養方法，具體步驟如下：

（1）菌種的準備：將斜面菌種或甘油凍存管或凍干管中菌種孢子或菌絲，在嚴格無菌條件下，接種至裝有100毫升種子培養基的500毫升帶擋板三角瓶中，在25-30℃條件下，在搖床上100—350轉/分培養3-6天，在嚴格無菌條件下，取樣，染色，鏡檢；

取菌種的斜面孢子在嚴格無菌操作條件下接入種子培養基中，在25-30℃，130-160轉/分的旋轉式搖床上培養3-4天，待菌絲長到一定濃度后，按1：1加入事先準備好的體積比為40%的無菌甘油，混合均勻，分裝至2毫升凍存管中，置-80℃保存，每次使用一支凍存管；

種子培養基、發酵培養基配方：甘露醇1-3%，大豆蛋白胨1-3%、酵母浸粉0.3-0.5%、碳酸鈣0.3-0.5%、氯化鈉0.3-0.8%；pH值6.5-7.5，每瓶裝100mL；

（2）擴大或發酵：待種子瓶長好以后，按體積3—10%的接種量轉入二級種子培養基或發酵培養基中；二級種子培養基或發酵培養基，發酵過程同第一級發酵；發酵過程需要5-7天，用HPLC檢測，待產物達到較高產量時即可放罐；

（3）發酵液預處理：在發酵完成后，用稀酸將發酵液pH調整到4-5，然后進行板框過濾或離心，得到上清液和菌絲體兩部分；

（4）上清液的處理：上清液處理方式有二：

①用薄膜濃縮器在50-60℃，0.1-0.09MPa條件下濃縮3-8倍后，加入防腐劑、穩定劑、表面活性劑，制成液劑產品；

所述防腐劑為：苯甲酸鈉或山梨酸鉀，

所述穩定劑為：黃原膠或瓊脂，

所述表面活性劑為：吐溫80或1231，

防腐劑、穩定劑、表面活性劑統稱助劑；

②采用萃取法或樹脂吸附法進行提取，

萃取法，將等體積的乙酸乙酯與發酵上清液混合，充分攪拌1±0.2小時，上清液中的活性物質就會轉移到溶劑中，分離出酯相，在減壓下蒸干，即得目標活性物質提取物；

所采用的減壓濃縮條件為：真空度0.1-0.09MPa，溫度40-60℃；

樹脂提取法，將大孔吸附樹脂按說明書進行預處理，然后按2%-5%的比例加入上清液中，200-400轉/分攪拌處理1-2小時，用40-100目篩網過濾，獲得樹脂，將收獲的樹脂用少量純水沖洗，然后按1：10-20的比例（W/V）加入乙酸乙酯，置容器中100-300轉/分攪拌30-120分鐘，棄去樹脂，將酯相分離出來，減壓濃縮即可獲得目標產物提取物；

所采用的減濃縮條件為：真空度0.1-0.09MPa，溫度40-60℃。

刺糖多胞菌HBERC-25376活性物質的分離方法，刺糖多胞菌的活性物質有刺糖多胞菌HBERC-25376的活性物質束霉素(Bundlin A)、結節霉素(Nodusmycin)、椒疫霉素(Capsimycin)，它們在同一菌種采用相同的培養基發酵時會同時產生；