[發(fā)明專利]一種預(yù)示和鑒定綿羊羊毛長度的分子標(biāo)記方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310236598.X
• 申請(qǐng)日: 2013-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN103276098A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王寧;榮恩光;閆曉紅;喬書培;王宇祥;楊華;李輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 牟永林

1.一種預(yù)示和鑒定綿羊羊毛長度的分子標(biāo)記方法，其特征在于它按以下步驟進(jìn)行：

一、采用苯酚/氯仿法從中國美利奴羊的耳組織中提取綿羊基因組DNA，根據(jù)綿羊DKK1基因第4外顯子區(qū)的c.576A＞G位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物DKK1F1和DKK1R1，然后對(duì)綿羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再用內(nèi)切酶Pvu?I酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；

二、使用濃度為2.5％的瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，然后根據(jù)電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定，判定的標(biāo)準(zhǔn)：①電泳呈現(xiàn)一條帶，大小為119bp，則綿羊DKK1基因第4外顯子區(qū)c.576A＞G位點(diǎn)未突變，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被內(nèi)切酶Pvu?I酶切，將其命名為AA基因型；②電泳呈現(xiàn)兩條帶，大小分別為91bp和28bp，則綿羊DKK1基因第4外顯子區(qū)c.576A＞G位點(diǎn)突變，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠被內(nèi)切酶Pvu?I完全切開，將其命名為GG基因型；③電泳呈現(xiàn)三條帶，大小為依次為119bp、91bp和28bp，則綿羊DKK1基因第4外顯子區(qū)c.576A＞G位點(diǎn)處于雜合狀態(tài)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被內(nèi)切酶Pvu?I完全切開，將其命名為AG基因型；

三、根據(jù)中國美利奴羊?qū)嶒?yàn)群體的特點(diǎn)，構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型：Y＝μ+G+L+A+G×L+G×A+L×A+e，其中Y為性狀的觀測值，μ為群體均值，G為基因型效應(yīng)，L為品系效應(yīng)，A為年齡效應(yīng)，G×L為基因型和品系的互作效應(yīng)，G×A為基因型和年齡的互作效應(yīng)，L×A為品系和年齡的互作效應(yīng)，e為剩余值效應(yīng)，然后利用JMP4.0統(tǒng)計(jì)軟件將基因型效應(yīng)與羊毛性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并估計(jì)性狀的最小二乘均值，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，綿羊DKK1基因第4外顯子區(qū)的c.576A＞G位點(diǎn)突變引起的基因型效應(yīng)與中國美利奴羊?qū)嶒?yàn)群體的羊毛長度顯著相關(guān)，P＝0.0232＜0.05，再進(jìn)行多重比較，3種基因型中具有GG基因型個(gè)體的羊毛長度顯著高于AA基因型和AG基因型個(gè)體的羊毛長度；

四、依據(jù)基因型將中國美利奴羊?qū)嶒?yàn)群體分為三種類型，組建GG基因型個(gè)體為主的羊毛長度性狀育種群體，有效培育出長度高的細(xì)毛綿羊品系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)羊毛長度的分子標(biāo)記輔助育種，即完成預(yù)示和鑒定綿羊羊毛長度的分子標(biāo)記方法；

其中步驟一中DKK1F1的核苷酸序列為：5′-AAGAAGGTACCGTCTGTCTTCGCTCGATC-3′；DKK1R1的核苷酸序列為：5′-TGCTTGGTGCACACTTGACCTTCCTT-3′；

步驟二中內(nèi)切酶Pvu?I所識(shí)別的堿基序列為CGATCG；

步驟三中中國美利奴羊?qū)嶒?yàn)群體的特點(diǎn)：①、733只中國美利奴羊?yàn)樾陆妷ㄐ?；②、超?xì)毛品系180只、毛用多胎品系138只、A品系148只、B品系102只、U品系35只和肉用多胎品系130只；③、均為母羊；④、年齡為2～10歲。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種預(yù)示和鑒定綿羊羊毛長度的分子標(biāo)記方法，其特征在于步驟一中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10μL反應(yīng)體系，由下列成分組成：

PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸8s，共33個(gè)循環(huán)，再72℃延伸7min，4℃保溫。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種預(yù)示和鑒定綿羊羊毛長度的分子標(biāo)記方法，其特征在于步驟一中酶切的體系如下：

酶切條件為：37℃酶切1-2h。