[發明專利]一種納米抗體融合蛋白及其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201310236483.0
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN103333253A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 曹鵬;張雙全;夏志南;喬波
• 申請（專利權）人: 南京瑞必得生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;G01N33/68;A61K39/395;A61K47/48;A61P37/02
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明涉及人免疫球蛋白可結晶片段（crystalizable?fragment，Fc）融合駱駝抗人TNFa納米抗體的表達制備。用這種方法制備的融合納米抗體蛋白anti-TNF-VHH-Fc，具有更高的抗原結合能力，可用于人類相關疾病的治療。

背景技術

TNF超家族成員在各種人類疾病的發病機制中發揮著重要作用。因此，這一超家族代表了一種活躍的藥物開發靶點。各種針對TNF家族成員的抗體藥物及其受體已被FDA批準，還有一些正在進行臨床試驗。這些試劑可以有效預防風濕性關節炎、銀屑病關節炎、銀屑病、潰瘍性結腸炎和克羅恩病。TNFa為腫瘤壞死因子，針對TNFa已被批準的治療方法主要是兩種：一種是可溶性受體，結合循環的TNFa以阻止TNFa與細胞表面受體相互作用；一種是TNFa的抗體，如Golimumab是一個完全人源化的TNFa單克隆抗體，可以特異性針對人的TNFa，并且已被批準治療風濕性關節炎、銀屑病關節炎以及強直性脊柱炎。與此類似，Certolizumab?pegol，一種聚乙二醇化抗人TNFa抗體Fab片段也已用于疾病治療。大多數TNFa阻滯劑的主要問題之一是它們會產生很多副作用。例如，英夫利昔單抗(Remicade)、依那西普(Enbrel)和阿達木單抗(Humira)都是免疫抑制劑，會增加嚴重感染風險（如肺結核）同時也會增加中樞神經系統脫髓鞘疾病的風險。使用英夫利昔單抗發生不良反應的患者已被研究和報道，風險包括嚴重的有時可以產生致命的血液疾病、嚴重感染、淋巴瘤和實體腫瘤、嚴重的肝損傷、乙型肝炎復發、肝脾的T細胞淋巴瘤、藥物引起的狼瘡等。使用英夫利昔單抗也會導致白細胞減少癥、中性粒細胞減少癥、血小板減少癥和全血細胞減少癥。除了安全問題，大部分的TNFa拮抗劑都十分昂貴。例如，每個病人一年的英夫利昔單抗費用可達22000美元。因此，更加安全、可負擔的起的、有效的備選方案是迫切需要的。

駱駝重鏈抗體缺失輕鏈和CH1恒定區，其重鏈可變區(VHH)直接通過鉸鏈與Fc結構域連接。雖然缺失輕鏈，HCAb卻可正常識別和結合抗原，與抗原結合的親和力達到納摩爾(nmol)級，與scFv單鏈抗體親和力相當。納米抗體具有高結合親和性，人癌胚抗原(carcinoembryonic?antigen,CEA)單域重鏈抗體對CEA的結合親和性為0.34-55nmol/L，高于小鼠(2.5nmol/L)或人(7.7nmol/L)抗-CEA單鏈抗體對CEA的結合親和性。而且FR2區保守序列中含有幾個具有親水性的氨基酸，使得VHH單域抗體具有水溶性好的特點。試驗表明，原核表達的VHH抗體在高達10mg/mL濃度時，仍不發生聚集，具有良好的可溶性。由于VHH單域抗體具有可逆重折疊性質，在高溫(80-92℃)和高濃度變性劑作用下仍保持抗原結合活性。對迄今得到的VHH單域抗體的穩定性分析表明這些抗體都相當穩定。篩選出的VHH單域抗體與傳統抗體相比，在大腸桿菌中較易表達和純化，搖瓶培養的表達水平通常為10mg/L；而用釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)搖瓶培養可以達到100mg/L以上，10L補料分批發酵可以達到1g/L以上，15m³發酵可以達到1kg以上，表達穩定，適合于大規模生產，生產成本極大降低。

抗體的Fc結構域通常包含每個鏈的至少兩個重鏈恒定區結構域，其二聚化形成Fc結構域。研究表明，與可溶性受體和抗體Fab片段相比較，TNFa的抗體能夠通過膜結合TNFa在人T細胞和巨噬細胞中轉導凋亡信號，并且交聯Fab片段以增加抗體的穩定性也可以誘導細胞凋亡，暗示了多聚體的相互作用對于抗體誘發凋亡途徑從而增強抗體效應具有重要作用。已有研究報道IgG抗體骨架能夠誘導補體結合與抗體依賴的細胞毒性，而且Fc融合蛋白具有二價抗體的相似效應即在血液中有較長的半衰期和增強的抗原親和力。IgG融合蛋白的構建方式大多是將IgG的Fc(Hinge-CH2-CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端與活性蛋白的C端相連，以避免構建融合蛋白可能對活性蛋白生物活性造成的影響。此外，IgG的融合蛋白可以通過ProteinA親和層析得到高效便捷的純化。因此盡管很多細胞因子與IgG的融合蛋白還處于研究的前期階段，但是由于其高效性、半衰期長及純化方便的特點已經引起廣泛的關注。