[發明專利]重組調控生物元器件強化次級代謝產物生物合成的方法

有效

• 申請號: 201310235689.1
• 申請日: 2013-06-15
• 公開（公告）號: CN103361345A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 洪文榮;肖海鵬
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/02;C12N15/87
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于基因組改良重組領域，更具體的涉及一種重組調控生物元器件強化次級代謝產物生物合成的方法。

背景技術

提高工業微生物產量，降低消耗，減少污染，提高經濟效益是微生物工程和代謝工程的研究重點，同時也是微生物學科研究的難題和熱點，是生命科學研究的重要領域。

隨著分子生物學技術的飛速發展，基因工程，蛋白質工程，微生物分子遺傳學工程相繼應運而生；隨著計算機科學的發展，生物信息學應運而生，并很快融入了分子生物學，這些學科的相互交融，使得基因工程如虎添翼，以飛快的速度推動了工業微生物基因組改良的發展，并逐步上升到應用階段的研究。

重組生物元器件導入各種工業微生物，進而改良重要微生物的功能，是發達國家力爭控制生命科技制高點的重要戰略，是后基因組時代競爭的焦點。

工業微生物基因組改良是微生物工程技術研究前沿的代表，其研究內容，技術特征獨樹一幟。借助生物元器件重組，改良藥用微生物特征，具有極大的科學意義和現實意義，對國民經濟發展具有潛在的、不可估量的經濟價值。

本研究以藥用小單孢菌為例，闡述采用重組生物元器件，改良并強制調控藥用微生物生物合成基因簇的轉錄，達到高效表達，提高次級代謝產物產量的全過程。本研究也適合于相關藥用微生物的基因組改良。

小單孢菌(Micromonospora)被稱為稀有放線菌，是重要的藥用微生物，能產生豐富的化合物，特別是氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素，小諾霉素和西索米星等。氨基糖苷類抗生素是臨床上重要的抗感染藥物，最新研究表明該類抗生素還具有抗病毒功效。小單孢菌產生的抗生素，對農業和醫藥等領域的貢獻巨大，但藥用小單孢菌發酵單位，生物合成能力一直難以提高。

依紐小單孢菌是西索米星產生菌。西索米星（sisomicin，SM）是重要的氨基糖苷類抗生素，屬廣譜抗感染藥物。西索米星可在其脫氧鏈霉胺環上的1-N位上，以乙基取代而得到半合成氨基糖苷類抗生素—奈替米星（netilmicin），其抗菌作用和安全性都優于西索米星，耳毒副作用較低，療效好。美國Achaogen公司對西索米星進行結構修飾的衍生物—ACHN-490，被譽為“新一代氨基糖苷類抗生素”。該衍生物對產氨基糖苷類鈍化酶的葡萄球菌、腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和不動桿菌具有良好的抗菌活性，該藥物有望替代替加環素，多粘菌素，被認為是一種對抗全世界醫療機構耐藥菌的潛在有效媒介。

早期對產西索米星的小單孢菌進行改良，主要采用傳統的經典常規誘變育種和生產工藝優化，但收效甚微。二十世紀八十年代興起的基因工程研究，雖然在抗生素生物合成基因的克隆、產量提高、及雜合抗生素生產等方面取得長足進步。但在小單孢菌研究上，始終未能取得實質性進展。因此選擇依紐小單孢菌進行基因組改良，特別是生物調控元器件組裝的改裝，具有代表性，且有特殊的實用意義。

基于T7噬菌體編碼的T7RNA聚合酶能選擇性地激活T7啟動子，并高效啟動下游基因的轉錄。而生物元器件(lacI、lacP、lacO、T7RNApol、T7promoter)偶聯，在大腸桿菌基因表達中已經得到驗證與應用。科學家還發現哺乳類動物細胞轉錄系統也能啟動T7?Ⅲ類啟動子。同時，Sanding利用α-amanitine進行體外轉錄實驗，認為T7?Ⅲ類啟動子能被真核生物RNA聚合酶Ⅱ所識別。相關研究也報道了利用核定位信號修飾的T7RNA聚合酶，所構建的串聯表達系統，應用于植物基因表達的研究。但噬菌體的重要系列生物元件如何進行巧妙組裝，導入藥用微生物，特別是跨屬小單孢菌，整合到染色體的什么位點，如何進行調控等，是一個未曾研究的科學難題。本發明正是針對這些難題，對重要的噬菌體生物元器件進行合理組裝，并插入小單孢菌生物合成基因簇，大幅度地提高次級代謝產物的產量，取得了顯著效果。

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發明內容

本發明的目的是通過研究利用調控生物元器件，強化藥用微生物次級代謝產物生物合成基因簇的轉錄與表達，獲得高產工程菌，提高次級代謝產物的產量。本發明提供了一種重組調控生物元器件強化次級代謝產物合成的方法，適用于相關藥用微生物次級代謝產物生物合成基因簇的改良。