[發明專利]一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段及其應用

有效

• 申請號: 201310235337.6
• 申請日: 2013-06-14
• 公開（公告）號: CN103275998A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 李瑋;張金秀;王立安;李天云;陳嬌嬌;鞠建松;薛張偉;張琳琳;張慶
• 申請（專利權）人: 河北博倫特藥業有限公司;河北師范大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊新世紀專利商標事務所有限公司 13100
• 代理人: 張素靜

技術領域

本發明涉及一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段及其應用，屬于基因工程、酶工程、生物醫藥領域。

背景技術

羥脯氨酸(Hydroxy?proline,?Hyp)?不屬于常見20種氨基酸，是脯氨酸羥基化修飾的結果，羥基通常加在第4或是第3位碳上。由于有兩個不對稱的碳原子，所以羥脯氨酸有4種立體異構體。分別為反式-4-羥基-L-脯氨酸，順式-4-羥基-L-脯氨酸，反式-3-羥基-L-脯氨酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。

反式-4-羥基-L-脯氨酸在哺乳動物細胞中主要存在于膠原蛋白中，對形成穩定的三股螺旋膠原蛋白具十分重要的作用，可使結締組織的彈性和韌性得到加強（Shibasaki,?T.?Mori,?H.?ozaki,?A.?2000）。體液羥脯氨酸平衡失調會造成許多疾病，例如營養不良，老年癡呆癥，牙齒、骨骼中的軟骨和韌帶組織的韌性減弱以及組織纖維化疾病等（Rajesh?N.?Kalaria,?Andrea?B.?Pax?.?1995）。

近年來，羥脯氨酸的研究和開發已引起醫藥、生化、食品及美容業等方面的廣泛關注。在醫藥方面，由于其具有多種生理功能與獨特的生物活性，可作為各種軟組織疾病的藥物，如結締組織受損、風濕性關節炎等，又可加快傷口愈合，治療各種皮膚疾病。反式-4-羥基-L-脯氨酸易于衍生化，藥理活性多樣，近年來逐漸被應用到醫藥原料藥手性中間體領域，用于合成新一代培南類抗生素、抗腫瘤、?抗高血壓及新型胃藥等多種新創制藥物的合成。由于其具有抗氧化、抗輻射的作用，在美容業方面，可以作為化妝品添加劑。目前，世界用量為500噸/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趨勢。

目前，我國反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產主要采用化學水解提取工藝，以動物膠原蛋白為原料，通過強酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程制備，?“三廢”排放量大、污染嚴重，能耗高、純度低及生產成本高。因此，利用節能、污染少的生物催化法生產反式-4-羥基-L-脯氨酸勢在必行。

生物轉化法是指利用細菌或真菌細胞中的酶將底物分子轉化為功能產物的過程。反式-4-羥基-L-脯氨酸生物轉化法是指利用L-脯氨酸為底物，在Fe²⁺、α-酮戊二酸和L-抗壞血酸存在的條件下，利用反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶轉化生產反式-4-羥基-L-脯氨酸。反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因（GenBank?ID：D78338.1）長816核苷酸，編碼272個氨基酸殘基，GC含量為66.67%，研究發現，該酶蛋白主要以包涵體形式出現（Christian?Kleina，Wolfgang?Huttela.?2011）。這種酶最早發現于鏈霉菌屬?P-8648菌株中（Sheehan,J.C.,?H.G.Zachau,?and?Lawson.?1958）。日本協和發酵公司經過菌株的大量篩選，從自然界中篩選到一株具有反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶活性的孢囊菌屬菌株，并且利用此菌株反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因，構建了L-羥脯氨酸生物合成工程菌，進一步提高了L-羥脯氨酸的產量，專利號為：ZL94115662.1。隨后，日本科學家利用該菌株中的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因，根據宿主菌的偏好性和密碼子的兼并性對該基因進行了密碼子的同義突變，構建了不同表達載體進行酶的表達和活性檢測研究，發現含有串聯雙色氨酸啟動子的表達載體酶活性最高，催化L-脯氨酸轉化成反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉化效率可高達87%。但他們構建的表達載體不是常見載體，構建過程十分的繁瑣，轉化過程是直接將底物加到培養中的大腸桿菌工程菌培養基中，培養基成分復雜，不易于后續的分離純化，在工業化利用方面存在一定缺陷性。2010年，德國科學家利用pET-28a作為載體，利用GroEL/GroES伴因子來提高酶的可溶性，轉化L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的能力是61%，轉化效率不高。

發明內容

本發明的目的是提供一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段，可用于高效轉化生產反式-4-羥基-L-脯氨酸。較全長酶，該基因片段編碼酶活性高，轉化效率高，轉化反應時間短，具有較好的工業應用前景。

本發明還提供所述基因片段的表達產物以及含有所述表達產物的工程菌的構建方法。

本發明還提供了所述基因片段的應用。

本發明實現上述目的采用的技術方案：

本發明提供的編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，其表達產物的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。