[發明專利]一種提取和濃縮Ⅱ型膠原的方法在審
| 申請號： | 201310234062.4 | 申請日： | 2013-06-14 |
| 公開（公告）號： | CN103352063A | 公開（公告）日： | 2013-10-16 |
| 發明（設計）人： | 張仲文;劉愛兵;靳凱鋒;許云飛 | 申請（專利權）人： | 張仲文;劉愛兵 |
| 主分類號： | C12P21/06 | 分類號： | C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/34 |
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| 地址： | 100039 北京市*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 提取 濃縮 膠原 方法 | ||
1.一種提取和濃縮II型膠原的方法，包括以下步驟：
(1)超凈臺中用手術刀剔取豬膝關節中透明的關節軟骨，超純水沖洗5次，95％的乙醇浸泡組織脫脂10min，超純水沖洗5次；
(2)稱取步驟(1)的關節軟骨，粉碎組織放入10倍體積4M的鹽酸胍(pH7.5)，攪拌24h，4℃操作；
(3)將步驟(2)的溶液攪拌過濾，留取濾液，15000r/m，30min離心，留取上清液，NaOH調整pH值至中性，4℃操作；
(4)將步驟(3)的上清液于12000r/m，30min離心，收集沉淀組織，用超純水透析，4h更換一次超純水，透析36h；
(5)向透析后的沉淀組織加入10倍體積的0.05mol/L乙酸和胃蛋白酶進行酶解，4℃攪拌72h；
(6)將步驟(5)的溶液過濾，收集濾液，15000r/m，30min離心，留取上清液用NaOH溶液調整pH值至中性，4℃靜置24h；
(7)將步驟(6)的上清液于12000r/m，30min離心，收集膠原沉淀，用超純水透析，4h更換一次超純水，透析36h，凍干形成II型膠原，干燥4℃冷藏備用；
(8)稱取制備好的II型膠原膜1000mg，溶于0.05mol/L乙酸，4℃攪拌24h，待膠原溶液完全溶解后，用100目濾網過濾膠原溶液；
(9)用NaOH溶液調整膠原溶液pH值至中性，13000r/m，10min離心，倒出上清液繼續低溫高速離心，14000r/m，10min，然后倒出上清液，繼續低溫高速離心，15000r/m，10min，收集三次離心的上清液，計算II型膠原濃度，取出膠原沉淀平鋪在培養皿中，凍干形成II型膠原膜，干燥4℃冷藏備用。
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