[發明專利]氦氧飽和高氣壓條件下細菌暴露生長模型生長艙室及應用

無效

• 申請號: 201310233952.3
• 申請日: 2013-06-13
• 公開（公告）號: CN103333788A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 陳雙紅;徐雄利;陳銳勇;陳海庭;王艷軍;翟宇佳;田力;李慈;武文斌;王明科
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍醫學研究所
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12N1/20
• 代理公司: 上海金盛協力知識產權代理有限公司 31242
• 代理人: 羅大忱

1.用于建立細菌暴露模型的氦氧飽和高氣壓細菌暴露生長艙室：其特征在于：?

⑴細菌飽和暴露時，氧分壓為40～50KPa；?

⑵細菌飽和暴露時，二氧化碳分為0.40～0.50KPa；?

⑶細菌飽和暴露時，溫度為30～35℃；?

⑷細菌飽和暴露時，濕度為50～60%；?

⑸細菌飽和暴露時，生長艙室環境氣密性要求4.6MPa保壓24小時泄漏率不大于1%；?

⑹細菌飽和暴露時，生長艙室氣體潔凈度要求18～24小時保壓，無其他氣源檢出。?

2.采用權利要求1所述的細菌暴露生長艙室，建立模型所需的細菌穩態生長的暴露方法，其特征在于，包括如下條件：?

⑴細菌暴露時，加壓的速率不小于0.3MPa/min，直至預定穩壓；?

⑵細菌暴露加壓時，以8～10%氦氧混合氣建立氧分壓，以純氦補充至終壓力；?

⑶細菌暴露加壓至穩壓時程不超過2h，優選的為0.5～1.0小時；?

⑷細菌暴露飽和停留時，氧分壓不大于50KPa，優選為40～50KPa；?

⑸細菌暴露飽和停留時，二氧化碳分壓不大于0.50KPa，優選為0.4～0.5KPa；?

⑹細菌暴露飽和停留時，艙室總壓力波動范圍不大于5m，優選為4.0～4.5m；?

⑺穩壓維持時，任何一種補充氣源的維持速率不大于1.2m/min，優選為1.0～1.2m/min；?

⑻細菌暴露結束后，減壓的速率不小于0.08MPa/min，優選為0.12～0.15MPa/min；?

⑼細菌暴露后減壓至12m以深氧分壓不大于50KPa，優選40～45KPa；?

12m以淺氧分壓不大于25%，優選為20～25%；?

⑽細菌暴露后，減壓的時間不小于1.5h，優選2.5～3.5小時。?

3.采用權利要求1所述的細菌暴露生長艙室和權利要求2所述的方法，穩態生長的銅綠假單胞菌模型的建立方法，包括如下步驟：?

⑴銅綠假單胞菌活化、傳代及對數生長期細菌培養；?

⑵銅綠假單胞菌暴露生長：?

①加壓生長時程不超過2小時；?

②穩壓飽和暴露生長時間不小于72小時，優選72～144小時；?

③減壓暴露生長時間不小于1.5小時，優選2.5～3.5小時；?

⑶暴露生長銅綠假單胞菌生長增殖的檢測：?

⑷暴露生長細菌基因型穩定性的測定；?

⑸暴露生長細菌誘導的毒力生長表型檢測。?

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）包括如下步驟：?

①用LB半固體斜面活化甘油菌，甘油體積濃度為35-50%；?

②LB-Broth固體培養基進行傳代培養，要求培養基添加Tc濃度10-20ng/ml、傳代次數不小于6代；?

③傳代細菌以LB液體培養基（添加Tc）進行指數生長細菌培養，培養時間不大于4h。?

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（3）包括如下步驟：?

①不同生長時相點暴露細菌的收集及處理；?

②處理后細菌OD650的測定；?

③繪制曲線并與同期普通環境生長細菌增殖曲線，要求細菌生長曲線有四個典型的生長期特征。?

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（4）包括如下步驟：?

①不同暴露生長時相點細菌的收集及基因組DNA的提取；?

②7個代表性看家基因（acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA?and?trpE）引物設計及ORF?PCR擴增的方法及步驟；?

③PCR擴增產物測序引物的設計、測序方法及序列比對，要求暴露細菌被檢測基因與同期生長標準菌序列相似度不小于97%，無gap標記；?

④序列信息的生物信息學分析,要求暴露細菌STs信息與同期暴露標準菌相比，平均變異系數H值趨近0，基因重組連鎖不平衡系數I_A^S趨近0。?

7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（5）包括如下步驟：?

①用半固體培養基檢測細菌的運動能力；?

②用底物代謝法測彈性蛋白酶活性；?

③用OD₅₂₀測綠膿菌素含量；?

④用秀麗隱桿線蟲模型檢測暴露菌毒力。?